顆粒劑四君子膏對脾氣虛模型大鼠心肌的保護作用*

孫豪嫻，孫貴香，肖 丹，鄧琳蓉，張 婷，厲佳俊

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

顆粒膏是以新型配方顆粒為原材料，運用現代科技工藝制作而成。不僅療疾以緩，功效滋補，而且攜帶方便，口感較好。顆粒膏的產生不僅解決了傳統膏劑制作繁瑣的問題，還節約了人力、物力資源。然而關于顆粒膏的功效一直是患者心中的困惑，且目前研究報道較少。本實驗通過復制脾氣虛模型大鼠來研究顆粒劑四君子膏對大鼠心肌結構、SOD、MDA的影響，并對四君子膏于大鼠心肌的保護作用進行探討。旨在以四君子膏為參考，對顆粒劑運用于膏劑制作上的功效做出評價，為臨床上顆粒劑膏的運用提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量180±20 g，購自湖南中醫藥大學，合格證號：SYXK（湘）2013-0005。在湖南中醫藥大學實驗動物中心進行實驗，實驗室內溫度控制在18～22℃，相對濕度維持在40%～70%。

顆粒劑四君子膏溶液：顆粒劑四君子膏由人參、茯苓、白術、炙甘草等組成，由深圳華潤三九醫藥有限公司提供配方顆粒，以《太平惠民和劑局方》為依據，四種藥物以3∶3∶3∶2的比例溶解濃縮，加入煉蜜收膏而成。再參照《人與動物用藥量換算表》70 kg成人的體表面積是200 g大鼠的56倍，按照正常成人一日服用膏滋40 g計算，3組大鼠服用的膏劑量分別為1.8、3.6、5.4 g/kg，將膏劑加蒸餾水分別制成含膏量為180、360、540 g/L的溶液，并放入冰箱儲存備用。四君子湯溶液：同顆粒劑四君子膏藥物組成比例，按書中原方劑量，采用傳統中藥煎煮方法煎煮至含生藥量為295 g/L的溶液保存。大黃制劑液：由大黃煎煮濃縮至生藥濃度為54 g/L而成。實驗中所用的中藥飲片亦由深圳華潤三九醫藥有限公司提供。大鼠超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒購自長沙鼎國生物技術有限公司（貨號：INS20180187）。

JE1002電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；WMY-01數字溫度計：上海醫用儀表廠；低溫高速離心機：美國sigma公司；EL34oi型全自動酶標儀：Molecular Devices公司。

1.2 動物模型復制 參考文獻[1-4]，采用飲食失節+耗氣破氣+勞倦過度的方法建立脾氣虛動物模型。實驗過程中采取隔日進食的方法控制大鼠進食量；每日上午按10 mL/kg灌服大黃制劑；在水溫為（22±2）℃的室內游泳槽中，每天下午強迫負重（按大鼠自身體重的10%計）游泳至力竭為止——大鼠鼻尖沒入水面大于10 s。

1.3 動物分組與給藥 SD大鼠60只，適應性喂養3 d后依次編號，采用國際上通用的編號表計，隨機分為正常組、模型組、四君子湯組、四君子膏低、中、高劑量組。正常組自由飲食，除同時灌服等量生理鹽水外不做特殊處理；實驗組在隔日進食、灌胃大黃制劑、負重游泳的基礎上，于每日下午各組分別灌服2 mL等量生理鹽水、四君子湯（2.95 g/kg）及顆粒劑四君子膏低、中、高劑量（1.8、3.6、5.4 g/kg）溶液，連續給藥28 d。

1.4 指標檢測 大鼠腹主動脈取血后開胸，夾取心臟，立即用低溫生理鹽水洗去殘留血液，濾紙吸干后于心尖處切取約1 mm×1 mm×1 mm的心肌組織，用多聚甲醛溶液固定，經酒精脫水處理后石蠟包埋，制備顯微鏡切片，常規HE染色，光學顯微鏡觀察心肌組織結構變化并攝影。剩余心肌組織準確稱重后低溫離心，制成心肌勻漿液，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，數據資料以“均數±標準差（±s）”表示。運用單因素方差分析法進行組間比較，采用LSD法和Dunnett法進行兩兩比較，取α=0.05為檢驗水準。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠活動靈敏，毛發有光澤，肛溫正常，體重逐日增加；模型組大鼠造模1周后出現稀便，便次增多，繼而出現體形瘦弱，蜷縮不好動，反應遲鈍，毛發蓬松無光澤，體重、肛溫均明顯低于正常組（P＜0.05），符合脾氣虛證的癥狀，參照田茸等[5]制訂的脾氣虛證模型大鼠的評分標準：倦縮扎堆1分；瞇眼弓背1分；食量減少1分；體質量減輕1分；便形質軟1分；便形溏稀2分；肛溫下降2分；游泳耐力下降1分。模型組大鼠得分為7分，大于5分，提示造模成功；四君子湯組、四君子膏低、中、高劑量組大鼠癥狀較模型組均有所減輕（P＜0.05），四君子膏組呈現出劑量趨勢；四君子湯組大鼠肛溫及體重變化與四君子膏中、高組存在差異（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠肛溫、體重情況（±s，n=10）

表1 各組大鼠肛溫、體重情況（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與四君子湯組比較，▲P＜0.05

▲四君子膏高劑量組 5.4 37.92±0.24△▲ 254.47±6.01△▲

2.2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平 相較于正常組，模型組大鼠心肌組織SOD活力水平顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；4組給藥組較模型組大鼠心肌SOD活力均升高，心肌MDA含量均降低（P＜0.05），并以四君子膏高劑量組最明顯；四君子膏中、高劑量組對提高大鼠心肌組織的SOD活力、降低MDA含量的作用強于四君子湯（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平（±s，n=10）

表2 各組大鼠心肌組織SOD、MDA水平（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與四君子湯組比較，▲P＜0.05

MDA/（nmol·mg-1）正常組 - 69.57±2.20 0.79±0.11組別 劑量/（g·kg-1）SOD/（U·mg-1）模型組 - 41.17±1.50* 1.42±0.06*四君子湯組 2.95 51.27±5.80*△ 1.19±0.13*△四君子膏低劑量組 1.8 51.42±4.59*△ 1.07±0.07*△四君子膏中劑量組 3.6 54.32±2.20*△▲ 1.03±0.07*△▲四君子膏高劑量組 5.4 65.53±3.15△▲ 0.85±0.10△▲

2.3 各組大鼠心肌結構比較 在400倍光鏡下觀察各組大鼠心肌組織HE切片，其中正常組大鼠心肌組織纖維排列整齊有序，心肌細胞大小、形態正常，染色均勻，周圍未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌組織纖維排列紊亂，部分組織正常結構消失，心肌細胞肥大、壞死，細胞間質增寬，間質細胞增多，水腫嚴重，周圍可見炎性細胞浸潤；給藥組大鼠心肌組織結構損傷均較模型組輕，其中四君子湯組及四君子膏低劑量組心肌組織間質增寬，存在輕度水腫、排列紊亂；四君子膏中劑量組心肌組織染色均勻，排列較整齊，存在輕度水腫；四君子膏高劑量組心肌組織與正常組相近，見圖1。

3 討論

3.1 脾氣虛證大鼠模型的建立和評價 動物造模的成功與否是決定實驗的關鍵，在近幾十年的研究過程中，脾氣虛證動物模型的建立從單因素造模的方法發展到現在普遍的復合因素造模的方法[6]。本實驗采用飲食失節、耗氣破氣結合勞倦過度的復合因素造模。脾胃為水谷之海，后天之本，脾胃功能的正常有賴于飲食規律節制，飲食失節，饑飽失常，則脾胃損傷。大黃味苦性寒，具有瀉下攻積，清熱瀉火之效，而《本草經疏》云：“脾虛忌下、降泄、破氣”，采用灌服大黃制劑液耗氣破氣后，大鼠可出現明顯脾氣虛癥狀[7]。張景岳云：“脾胃之傷于外者，惟勞倦最能傷脾”，脾胃為氣血生化之源，而勞倦易散氣耗氣，因此采取力竭游泳的方法使大鼠勞倦過度，可以較好建立脾氣虛證的動物模型[8]。實驗證明，采用上述3種因素聯合進行造模后，大鼠出現肛溫下降、體重減輕、飲食量減少、大便偏稀、蜷縮畏寒等癥狀，符合脾氣虛證的表現。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》具有益氣健脾的功效，是治療脾氣虛證的基礎方[9]。本實驗結果表明，大鼠灌服四君子湯后一般情況較模型組大鼠好，脾氣虛癥狀得以改善，有是證用是方，根據“方證對應”的邏輯理論[10-11]，說明所造模型為脾氣虛證模型。

3.2 四君子膏對脾氣虛模型大鼠心肌組織結構及SOD、MDA的影響 心肌組織結構的改變可以很直觀的反映心肌細胞的損傷程度，有學者發現脾氣虛大鼠心肌細胞存在不同程度的壞死[12]。SOD是生物體內存在的一種抗氧化酶，具有清除自由基，防止自由基損傷的作用，有研究表明SOD可以減輕組織的氧化應激損傷，保護心肌缺血再灌注損傷[13]。MDA是體內脂質過氧化作用的代謝產物，其含量的多少可以反映脂質過氧化的程度[14]。本實驗研究結果顯示，模型組大鼠心肌損傷明顯，心肌組織SOD活力水平顯著降低，MDA含量顯著升高，說明大鼠經脾氣虛造模后清除自由基能力減弱，心肌組織產生較多氧自由基受到損傷。經四君子制劑治療后各組大鼠情況均有所改善，其中四君子膏的效果在低濃度時與四君子湯相同，在中、高濃度時優于四君子湯，在高濃度時效果最好，說明四君子膏的功效值得肯定，顆粒劑四君子膏可以提高脾氣虛證大鼠心肌組織SOD活力，降低MDA含量，增強大鼠心肌組織抗氧化能力及自由基清除能力，減輕脾氣虛證大鼠心肌組織損傷。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE 400×）

3.3 探討四君子膏對脾氣虛模型大鼠心肌的保護作用 心者，君主之官，神明出焉；脾胃者，倉廩之官，五味出焉。《內經》書中載：“五臟相通，移皆有次”，心與脾之間存在著密切聯系，后世醫家對其進行了總結與延展，認為二者的關系主要體現在：母子相依：在五行上心屬火，脾屬土，二臟存在著母子相生、母子互病的關系；氣血互濟：“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈”《素問·經脈別論》），心主血脈，脾胃為氣血生化之源，心與脾在氣血上存在互濟的關系；經脈相貫：“脾足太陰之脈也……其支者，復從胃，別上膈，注心中”，心脾二臟通過經脈相貫，聯系互通；病理互制：基于心脾二臟間上述關系的特殊性，因此在病理上相互影響[15]。

四君子湯是治療脾氣虛證的一首基礎方，現代藥理學研究表明，方中的有效成分主要為多糖、皂苷、黃酮及揮發油類物質[16]，具有促進消化吸收、增強機體免疫、促進內分泌腺功能、延緩衰老等作用[17-19]。顆粒劑四君子膏則是以四君子湯為依據，由配方顆粒藥材以最新工藝熬制而成，既保留了四君子湯健脾益氣之功，又具備了膏劑滋補保健之效[20-21]。本實驗研究發現，脾氣虛證大鼠在出現脾氣虛癥狀的同時，其心肌組織亦存在較明顯損傷。而四君子膏可以通過提高心肌組織SOD活力，降低MDA含量，減少心肌損傷，從而達到對心肌組織的保護作用。《脾胃論》載“內傷脾胃，百病由生”，脾病及心，子病及母。實驗結果從另一方面說明了心脾二臟之間的關系性，同時為臨床“從脾論治”心系疾病提供了理論依據。

綜上可知，采用飲食失節+耗氣破氣+勞倦過度復合因素的方法可以建立良好穩定的脾氣虛大鼠模型。基于心脾二臟之間的生理、病理聯系，脾氣虛證模型大鼠心肌細胞存在損傷，心肌組織中的SOD活力水平下降，MDA含量升高。四君子制劑可以保護脾氣虛證大鼠的心肌組織結構，其中顆粒劑四君子膏的療效值得肯定，并在一定濃度上優于四君子湯。臨床上顆粒劑不僅可以運用于湯劑，亦可運用于膏劑的制作。