日糧中添加不同水平杜仲葉對牦牛瘤胃液體外發酵的影響

嚴欣茹， 楊尚霖， 郭春華*， 柏 雪， 張正帆， 萬國英

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，動物科學國家民委重點實驗室，四川成都 610041；2.貴州五新農業科技有限責任公司，貴州銅仁 554300）

杜仲（Eucommia ulmoides oliver）是杜仲科杜仲屬的多年生落葉喬木植物，是我國珍貴傳統中藥材。研究表明，杜仲中含有包括綠原酸、黃酮類、杜仲苷、鞣質、多糖、氨基酸在內的多種營養物質和活性成分（唐瑤等，2014），具有增強免疫力、降低體內脂肪、平衡血壓、抗菌消炎、抗應激、健筋骨、清熱利尿、抗衰老、抗氧化等多種藥理作用（趙瀅等，2014）。近年來，由于飼料中添加抗生素和化學藥物對畜禽產品品質產生極大的負面影響，杜仲作為抗生素代替物走進人們的視野。研究發現，在日糧中添加杜仲，能夠改善動物機體免疫系統的功能，提高機體防御能力，顯著促進動物生長，提高飼料利用率，改善肉質，提高風味。目前，杜仲作為飼料添加劑，已經應用于豬、家禽、魚類及部分反芻動物飼料中（梁松瓊等，2015）。

近年來，為提高牦牛生產效率，研究出放牧加補飼或者舍飼育肥模式（陳光吉等，2015），而杜仲在牦牛飼料中應用效果鮮見報道。本試驗通過體外模擬瘤胃內環境，進行體外產氣試驗，研究杜仲對牦牛瘤胃發酵及養分降解率的影響，為杜仲作為飼料添加劑在牦牛飼料中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 杜仲葉由貴州五新農業科技有限責任公司提供，取材于貴州省銅仁市。杜仲葉置于65℃烘箱烘干，粉碎后過40目篩，用塑料自封袋保存備用。

從西南民族大學青藏高原牦牛試驗基地 （位于阿壩州紅原縣），選取3頭體重相近成年健康牦牛，飼喂前用真空泵抽取瘤胃內容物，混合后用4層紗布過濾，封裝后迅速帶回實驗室備用。

1.2 試驗設計 采用單因素試驗設計，分為6個處理組，基礎日糧精粗比為50∶50，分別用0%（對照組）、1%、2%、3%、4%、5%的杜仲葉替代基礎日糧中的粗料，每個處理組設4個重復。試驗日糧組成及營養水平見表1。

表1 試驗日糧組成及營養水平（風干基礎）%

1.3 體外發酵 培養液的配制參照Menke（1988）的方法，人工唾液配制見表2。加入1%刃天青數滴，持續通入CO2去除氧氣直至緩沖液由紅色變成無色為止，現配現用。然后將瘤胃液與人工唾液按1∶2體積比配制成體外混合培養液。將配制好的混合培養液持續通入CO2氣體并置于39.5℃的恒溫水浴鍋中預熱備用。體外培養裝置為100 mL具塞塑料注射器，內有刻度，注射器前端連接一條5 cm的硅膠軟管，并用止水夾將軟管夾緊。試驗前分別準確稱取1000 mg底物置于注射器底部，然后吸入50 mL混合培養液，輕微震蕩搖勻并排出氣泡后置于（39±0.5）℃的恒溫培養箱中培養72 h。每個處理四個重復，并設置一個空白對照管（僅含有混合培養液）以減少系統誤差。 分別記錄 2、4、6、9、12、24、36、48、72 h各時間點的產氣量，每間隔2 h輕微搖勻注射器 （劇烈發酵后會出現固液相分離的現象），每次記錄產氣量后推動活塞至初始刻度。待培養72 h后，將塑料注射器取出，放入冰水浴中使發酵停止。

表2 人工唾液配制

1.4 指標測定及方法

1.4.1 發酵指標測定 體外培養72 h后立即用冰水浴終止發酵后，將培養液無損的轉移至50 mL離心管中，立即用PHB-5型便攜式pH計，測定培養液的pH；NH3-N的測定參考馮宗慈等（2010）的比色法；MCP濃度的測定參照Makkar等（1982）的方法。

1.4.2 常規營養成分的測定 飼料原料和培養液固相殘留物中CP、DM、Ash、ADF和NDF含量的測定均參照張麗英（2003）的方法。 DMD、CPD、ADFD和NDFD的計算參照馬艷艷等（2014）的方法。

1.5 數據統計及方法 產氣量/mL=該段時間內培養管產氣量-空白管產氣量。產氣動力學參數的計算參照France等 （2000）提出的計算模型：GP=b×（1-e-c（t-L）），使用 SPSS 18.0 統計軟件中非線性回歸程序進行產氣參數估計。其中GP表示培養t時間點的產氣量，mL；e為自然對數；t為培養時間，h；b為潛在最大產氣量，mL/g DM；c為產氣速率，h；L為產氣前的延滯時間，h。添加杜仲葉的處理組與對照組進行單一自由度的方差分析。以P＜0.05為差異顯著性判斷標準，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉營養成分 實驗室測定的杜仲常規營養成分中，DM含量為92.82%，干物質基礎上，CP含量為12.15%，EE含量為4.20%，Ash含量為9.71%，NDF含量為45.31%，ADF含量為33.07%。

2.2 體外發酵動力學參數特點 產氣參數如表3，體外發酵72 h后，各組總產氣量（GP）、最大潛在產氣量（b）、產氣速率（c）及產氣前停滯時間（L）差異均不顯著（P＞0.05）。由圖1體外產氣曲線可以看出，0～24 h產氣速率逐漸變大，24 h后速率逐漸放緩，各組總體趨勢相同，72 h總產氣量均接近或達到最大潛在產氣量。

表3 不同添加水平72 h產氣量和產氣動力學參數

圖1 72 h體外產氣曲線

2.3 體外發酵DMD、CPD、NDFD和 ADFD的特點 由表4可知，不同添加水平的杜仲葉對DMD、CPD、NDFD和 ADFD有極顯著的影響（P＜0.01）。本試驗中，隨杜仲葉添加水平的提高，日糧中DMD、CPD、ADFD和NDFD呈二次曲線變化（P＜0.01）。如圖2、圖3所示，與對照組相比，1%組、2%組、3%組、4%組、5%組的 DMD分別 提 高 8.85% 、9.15% 、11.90% 、15.47% 、14.55%，CPD分別提高 2.20%、4.11%、8.59%、10.72%、7.27%，NDFD分別提高 5.11%、7.11%、9.50% 、13.31% 、6.83% ，ADFD 分 別 提 高11.96%、15.17%、16.57%、16.57、18.60%、11.25%。在添加量為4%時達到最大值，添加量提高到5%時，日糧中DMD、CPD、ADFD和NDFD顯著降低（P ＜ 0.05）。

表4 不同添加水平72 h發酵后DMD、CPD、NDFD 和 ADFD

圖2 不同添加水平72 h發酵后DMD和CPD

圖3 不同添加水平72 h發酵后NDFD和ADFD

2.4 體外發酵pH、NH3-N和MCP濃度特點由表5可知，各試驗組之間的pH差異均不顯著（P ＞ 0.05），變異范圍在 6.33～ 6.37，均屬于瘤胃微生物生長的正常范圍；各試驗組的NH3-N和MCP濃度差異極顯著（P＜0.01），如圖4所示，與對照組相比，1%組、2%組、3%組、4%組、5%組的NH3-N濃度分別降低 4.05%、4.73%、8.68%、11.03%、12.99%，MCP濃度分別提高 104.55%、204.55%、222.73%、236.36%、236.36%。 NH3-N 濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈線性下降，而MCP濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈二次曲線變化，添加量為1%～3%時MCP濃度顯著增加，當添加量為3%以上時，MCP濃度的增加速率變緩，達到一個平臺。

表5 不同添加水平72 h發酵后pH、NH3-N濃度和MCP濃度

圖4 不同添加水平72 h發酵NH3-N和MCP濃度

3 討論

3.1 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體外產氣量的影響 產氣量是綜合評價日糧發酵程度的重要指標，不僅能夠體現瘤胃微生物的活躍程度，也能反映日糧蛋白質營養水平，產氣量的大小與日糧中有機物的降解程度呈正相關 （黃雅莉，2014）。本試驗中，各組發酵72 h后的總產氣量差異不顯著，但是各試驗組的總產氣量均值呈先增加后降低趨勢，4%組的產氣量達到最大值，與本試驗中DMD趨勢基本一致，各組差異不顯著，可能是因為本試驗采用的體外發酵裝置，只是模擬瘤胃環境，與真實的瘤胃環境還存在一定差異，所以不能顯著體現各組產氣量的差異。

3.2 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體外DMD、CPD、NDFD 及 ADFD 的 影 響 DMD、CPD、NDFD和ADFD能夠反映瘤胃微生物對底物分解程度的強弱（趙慧娟等，2006）。瘤胃微生物對發酵底物的降解程度不僅與微生物活性有關，還與發酵底物的組成有關。本試驗中，DMD和CPD顯著提高，在添加量為4%時達到最大值后下降，可能是因為隨著杜仲葉添加量的增加，供瘤胃微生物發酵利用的碳水化合物和營養物質增加，使體外發酵DMD和CPD呈上升趨勢。孟梅娟等（2016）的試驗中，NDFD和 ADFD先增加后降低，本試驗中，隨著杜仲葉添加量的增加，體外發酵72 h后的 NDFD和ADFD先增加后降低，在添加量為4%時達到最大值，可能是杜仲葉的添加，增加了日糧中的可發酵物質，加快微生物對發酵底物的利用，但是當杜仲葉的添加量過大時，體外發酵可能受到抑制，NDFD和ADFD反而下降，因此杜仲葉應該適量添加。

3.3 添加杜仲葉對牦牛瘤胃液體發酵參數pH、NH3-N濃度和MCP濃度的影響 反芻動物對飼料營養物質進行消化吸收主要是通過瘤胃中的微生物發酵，而瘤胃液的pH是評價瘤胃內營養物質發酵和瘤胃穩定的重要指標，其直接反映瘤胃內生態系統的多樣性和動物體的健康狀況（Nagaraja等，2007）。在正常生理狀態下，反芻動物采食后，瘤胃中的pH呈動態變化，先逐漸下降再逐漸升高。李新等（2012）研究表明，反芻動物瘤胃液的pH正常變化范圍為5.5～7.5，本試驗瘤胃液pH均在6.33～6.46范圍內變化，并且隨著杜仲葉添加量的增加，無顯著變化。劉彩娟等（2011）研究表明，在日糧中添加復合益生菌對瘤胃pH影響不顯著；陳亮等（2017）研究植物乳桿菌對玉米秸稈和水稻秸稈體外發酵特性的影響，其結果對瘤胃pH影響不顯著，并且認為其對于維持pH的穩定平衡具有積極作用。本試驗結果與劉彩娟等（2011）和陳亮等（2017）的結果一致，表明在基礎日糧中添加不同水平的杜仲葉對瘤胃pH沒有影響。

NH3-N作為反映瘤胃發酵的一個重要指標，主要受日糧中蛋白質水平、瘤胃上皮的吸收作用、瘤胃微生物的合成與利用以及食糜的排空速度等因素的影響。瘤胃中適宜的NH3-N濃度才能保證微生物蛋白的正常合成。研究表明，瘤胃中的NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/100 mL時，最適宜微生物發酵 （Murphy等，1987）。本研究中72 h發酵后NH3-N的濃度為35.28～30.69 mg/100 mL，與 Murphy等（1987）研究中的 NH3-N 適宜濃度相比，本研究中的NH3-N濃度相對偏高，可能原因是由于在本試驗中采用的體外產氣裝置是塑料針筒，產生的部分NH3-N無法像在真正的瘤胃一樣被瘤胃上皮吸收和隨著食糜排出。史仁煌等（2015）研究表明，日糧中添加杜仲素顯著降低了瘤胃中的NH3-N濃度。本試驗中，NH3-N的濃度隨著杜仲添加量的增加顯著降低，與史仁煌的研究結果一致，可能原因是杜仲葉中含有多種具有抑菌作用的物質，不同程度的抑制產氨活性較強的專性氨基酸發酵菌的活性，從而降低瘤胃中NH3-N的濃度。

瘤胃中MCP濃度的高低可反映瘤胃微生物利用NH3-N的能力，同時，也可反映瘤胃中微生物種群的數量，MCP可為反芻動物提供蛋白質需要的40%～80%，是主要的氮源提供者。本試驗中，瘤胃MCP濃度隨日糧中杜仲葉添加量的增加而顯著增加，可能是因為杜仲葉中富含多糖類化合物，可為瘤胃微生物提供更多的營養成分，從而促進瘤胃微生物利用NH3-N合成MCP。董金金等（2018）研究表明，日糧中添加酵母多糖，可降低瘤胃液中NH3-N濃度，提高MCP濃度，與本試驗結果一致，說明日糧中添加杜仲葉能夠促進牦牛瘤胃中有益菌的生長繁殖，提高氮的利用率，合成更多的MCP。

4 小結

日糧中添加杜仲葉對瘤胃體外發酵總產氣量、最大潛在產氣量、產氣速率、產氣前停滯時間和pH均沒有影響；日糧中添加杜仲葉可顯著提高日糧DM、CP、ADF及NDF的降解率，并隨添加量的增加呈二次曲線變化，當添加量為4%時，達到最大值；瘤胃液中NH3-N濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈線性下降，而瘤胃液中MCP濃度隨杜仲葉添加水平的提高呈二次曲線變化，添加量為3%時，MCP濃度達到峰值。日糧中杜仲葉適宜添加量為3%～4%。