pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA真核表達干擾載體構(gòu)建與鑒定

朱家佳 龍鼎新

(南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001)

鈣蛋白酶(calpain)是一組保守的特異性依靠鈣激活的中性半胱氨酸蛋白酶，其活性主要與細胞內(nèi)Ca2+濃度有關[1]。在機體的生理過程中，鈣蛋白酶發(fā)揮著關鍵作用，其不僅參與蛋白的降解，還參與細胞骨架重構(gòu)、細胞周期調(diào)控與凋亡、自噬、葡萄糖轉(zhuǎn)運、細胞信號轉(zhuǎn)導等正常的生理過程[2-3]。Calpains主要由80KD的大亞基和30KD的小亞基(calpain-s1，capn4)組成[4]。作為調(diào)節(jié)亞基， CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是細胞凋亡和存活、細胞遷移所必需的[5]。CAPNS1包含結(jié)構(gòu)域Ⅴ和結(jié)構(gòu)域Ⅵ兩個結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅴ含大量疏水氨基酸和甘氨酸，具疏水作用；而位于C端的結(jié)構(gòu)域Ⅵ與大亞基結(jié)構(gòu)域Ⅳ結(jié)構(gòu)相似，能與Ca2+結(jié)合，對維持calpain功能具有重要的作用。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是細胞中靶特異性基因的選擇性轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的高度保守的過程[6]。自從發(fā)現(xiàn)以來，這種現(xiàn)象已經(jīng)成為基因沉默的有力工具，RNAi可對細胞中靶特異性基因進行選擇性轉(zhuǎn)錄后下調(diào)[7]。有研究表明[8]，RAN干擾是一種有效抑制基因表達的技術(shù)，RNAi已廣泛用于基礎生物研究和藥物開發(fā)過程，為治療遺傳性疾病、傳染性疾病、癌癥等疾病尋找到新的路徑。現(xiàn)有研究表明RNAi對基因功能的研究具有重要意義，其已成為基因生物學中闡明基因功能的金標準[6]。本研究旨在構(gòu)建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRAN載體，干擾CAPNS1基因的表達，為研究CAPNS1基因功能，研究calpain在自噬中的作用提供良好的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Hela細胞、大腸桿菌DH5a 和載體pYr-Lvsh(長沙贏潤生物技術(shù)有限公司)；各限制性內(nèi)切(Takara公司，日本)；T4DNA 連接酶、dNTP、RevertAidTMReverse Transcriptase、RiboLockTMRNase Inhibitor 和Taq DNA Polymerase(MBI公司，立陶宛)；總RNA提取試劑Trizol、Lip2000(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix (TOYOBO公司，日本)；mouse anti-calpain1(Sigma公司，美國)；rabbit anti-calpain2和rabbit anti-CAPNS1(Abcam公司，英國)；Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo life sciences公司，美國)。

1.2 shRNA載體構(gòu)建

1.2.1 shRNA序列選擇及設計 針對靶基因人的CAPNS1基因(NM_001749)，根據(jù)shRNA靶位點的選擇原則，選取CAPNS1基因轉(zhuǎn)錄本的CDS區(qū)域中進行靶位點設計CAPNS1 shRNA序列。引物：CAPNS1-shRNA1-f：5’-GATCCCCATGTTCCGTGCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGCA-CGGAACATGGTTTTTG-3’；CAPNS1-shRNA1-r：5’-AATTCAAAAACCATGTTCCGTGCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGCACGGAACA-TGGG-3’；CAPNS1-shRNA2-f：5’-GATCCC-GCCACAGAACTCATGAACATCTCGAGATGTTC-ATGAGTTCTGTGGCGTTTTTG-3’；CAPN-S1-shRNA2-r：5’-AATTCAAAAACGCCACAGA-ACTCATGAACATCTCGAGATGTTCATGAGTTCTGTGGCGG-3’；CAPNS1-shRNA3-f：5’-GA-TCCGCTGCAG-CTGACTATGTATTCCTCGAG-GAATACATAGTCAGCTGCAGCTTTTTG-3’；C-APNS1-shRNA3-r：5’-AATTCAAAAAG-CTGCAGCTGACTATGTATTCCTCGAGGAA-TAC-ATAGTCAGCTGCAGCG-3’。

1.2.2 shRNA引物退火 將上述shRNA引物用退火B(yǎng)uffer(10mM Tris-HCl pH8.0、50 mM NaCl、1mM EDTA)分別溶解，然后置于沸水中，自然退火。

1.2.3 shRNA載體酶切線性化 將shRNA載體pYr-Lvsh用內(nèi)切酶BamHI和EcoRI于37 ℃進行雙酶切過夜，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收大片段產(chǎn)物。

1.2.4 鏈接與轉(zhuǎn)化 用T4 DNA Ligase將退火產(chǎn)物與線性化的pYr-Lvsh于4 ℃進行鏈接，并過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，涂布于含有抗性Ampr的LB平板，并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落，接種于Ampr抗性LB培養(yǎng)液37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 酶切鑒定與測序 挑取多個單克隆，提取質(zhì)粒。由于pYr-Lvsh原載體上，有一個XhoI酶切位點(CTCGAG)，當外源的shRNA片段成功插入，則會帶入一個新的XhoI酶切位點(即Loop環(huán)序列)，兩個XhoI之間的片段長度約為2.1 K。因此，重組載體可以用XhoI來進行酶切鑒定并用XhoI酶對重組載體進行酶切鑒定。 最終將酶切鑒定正確的克隆送往長沙嬴潤生物技術(shù)公司作測序鑒定。測序引物為U6-5’ 測序引物：5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’。

1.3 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將Hela細胞置于6孔板中，分別轉(zhuǎn)染pLV-shCAPNS1和pLV-shNC組。按照Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行操作。轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，收集細胞前觀察各組細胞綠色熒光情況，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qPCR檢測 各組細胞中CAPNS1 mRNA表達情況 Trizol法提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)qPCR引物的設計原則，參考GenBank中CAPNS1的mRNA完全序列，設計qPCR引物，選用GAPDH基因作為內(nèi)參，熒光定量PCR進行擴增，2一△△ Ct法計算各組CAPNS1 mRNA表達量。引物序列見表1。實驗設置3個副孔，重復3次實驗。

表1 擴增基因的qPCR引物序列和PCR產(chǎn)物大小

1.5 Calpain活性檢測 提取對照組細胞和sh-CAPNS1細胞蛋白，BCA檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白稀釋到含有50 μM熒光底物琥珀酰化多肽氨甲基香豆素(Suc-LLVY-AMC)的緩沖液中，37 ℃孵育15 min，激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長380 nm，熒光分光光度計測定熒光值，實驗設置3個副孔，重復3次實驗。

1.6 Western blot檢測 提取對照組Hela細胞株(NC)和實驗組Hela細胞(sh-CALPAIN)的蛋白，BCA檢測蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，然后分別加入Mouse anti-Calpain1(1∶1 000)、Rabbit anti-Calpain2(1∶1 000)、Rabbit anti-CAPNS1(1∶1 000)、Rabbit anti-Actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。吸走一抗，TBST洗3遍，二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗5遍。最后用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影檢測蛋白表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 運用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 酶切鑒定 將pLV-CAPNS-sh質(zhì)粒進行XhoI酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示。得到一條約為2.1 kb的片段，與預計的片段大小一致，表明pLV-CAPNS1-sh酶切鑒定正確無誤。

注：M：DNA Marker(2K Plus II)；1：pLV-CAPNS1-shRNA1 經(jīng)XhoI酶切；2：pLV-CAPNS1-shRNA2 經(jīng)XhoI酶切；3：pLV-CAPNS1-shRNA3 經(jīng)XhoI酶切。

圖1 pLV-CAPNS1-sh酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒測序分析 將重組質(zhì)粒送往長沙贏潤生物技術(shù)公司進行測序并將測序報告與欲獲得的shRNA序列進行比對，可知質(zhì)粒中插入的shRNA序列都是正確的，提示pLV-CAPNS1-sh構(gòu)建成功，見圖2。pLV-CAPNS1-sh質(zhì)粒圖譜見圖3。

注：A、B、C分別表示pLV-CAPNS1-shRNA1、pLV-CAPNS1-shRNA2、pLV-CAPNS1-shRNA3質(zhì)粒測序圖。

圖2 pLV-CAPNS1-shRNA測序結(jié)果

圖3 pLV-CAPNS1-sh質(zhì)粒圖譜

2.3 Hela細胞轉(zhuǎn)染及Real-time qPCR檢測CAPNS1表達 將對照組質(zhì)粒和CAPNS1 shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，收集細胞前觀察各組細胞綠色熒光情況。轉(zhuǎn)染效率達80%以上，見圖4。與對照組相比，CAPNS1 shRNA轉(zhuǎn)染細胞48 h后，CAPNS1 mRNA表達下降，shRNA1、shRNA2、shRNA3組CAPNS1 mRNA表達分別下降了33.1%、36.7%、50.3%，見圖5。

注：A：對照質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染Hela細胞；B：pLV-CAPNS1-sh組轉(zhuǎn)染Hela細胞。

圖4 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞(200×)

注：與NC組相比，*P<0.05。

圖5 CAPNS1基因沉默后HeLa細胞中CAPNS1 mRNA水平變化

2.4 Calpain 活性變化 Calpain活性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3載體后，Hela細胞中calpain活性下降(P<0.05)，這也表明CAPNS1基因的干擾能夠降低calpain活性。見圖6。

注：與NC組相比，*P<0.05。

圖6 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3轉(zhuǎn)染細胞后Calpain活性變化

2.5 Western blot 檢測CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表達情況 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3載體轉(zhuǎn)染細胞后，Hela細胞中CAPNS1蛋白及受CAPNS1調(diào)節(jié)的calpain1和calpain2蛋白表達明顯降低，見圖7。

圖7 pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3轉(zhuǎn)染Hela細胞對CAPNS1、Calpain1和Calpain2蛋白表達影響

3 討 論

作為機體細胞內(nèi)蛋白降解的主要酶系之一，鈣蛋白酶系統(tǒng)對維持體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的平衡起著重要的作用。許多疾病與calpain的激活異常或失調(diào)有關[9]。Calpain在細胞周期、自噬、凋亡等過程中具有重要作用。研究表明，CAPNS1基因敲除后可致calpain1及calpain2活性下降，影響小鼠心臟發(fā)育，從而使其在妊娠中期死亡，表明CAPNS1在生物的生長和發(fā)育過程中起著重要的作用[5]。此外，有研究表明，CAPNS1對細胞自噬具有調(diào)節(jié)作用[2]。本課題組前期研究以及其他研究發(fā)現(xiàn)，calpain1和calpain2表達及活性的增加參與細胞自噬的調(diào)節(jié)[10]，但其機制至今還不是十分清楚，需進一步的研究。

RNA干擾是指雙鏈RNA誘導具有同源性的靶基因序列的mRNA高效且特異性降解，從而抑制基因表達，引起基因沉默。RNA干擾技術(shù)雖存在高效性、特異性、可遺傳等優(yōu)點，且被廣泛用于基因功能研究。但目前RNA干擾技術(shù)還存在脫靶效應、穩(wěn)定性差、載體安全性等問題。本研究將合成的shRNA連接到含U6啟動子載體的pYr-Lvsh質(zhì)粒載體中，經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定以及測序，結(jié)果顯示pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA載體構(gòu)建成功；同時，經(jīng)轉(zhuǎn)染Hela細胞后，細胞內(nèi)CAPNS1 mRNA表達下降，其中pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA3轉(zhuǎn)染細胞后其抑制效率最高，因此在后期選用其轉(zhuǎn)染細胞后測定細胞中calpain活性及CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)calpain活性降低且CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表達量下降，為研究calpain的功能提供了基礎。