黃芪、冬蟲夏草對新生鼠腎積水病腎TGF-β1、IGF-1表達的影響

趙鵬 馬洪 吳謀東,3 劉紅 楊遠貴 魯強 董淑荃

(1.遵義醫科大學附屬醫院小兒外科，貴州 遵義 563003；2.貴州航天醫院泌尿外科，貴州 遵義 563000；3.貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002)

腎盂輸尿管連接部梗阻(UPJO)所致腎積水是小兒泌尿系統常見的先天畸形之一。該病大多需手術解除梗阻，但新生兒腎積水特別是按胎兒泌尿外科(SFU)分級的0～Ⅱ級通常是不需要手術治療的[1]。黃芪、冬蟲夏草等對糖尿病腎病、腎小球腎炎等慢性腎病有保護作用[2-3]；因UPJO的腎損害也為一慢性過程，是否也有保護效應未見報道。為此，本研究以實驗動物模型為切入點，應用黃芪、冬蟲夏草進行干預，以探討黃芪、冬蟲夏草對先天性腎積水病腎損害有否保護作用，以期為臨床更好地治療該類病兒提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 SPF級成年Wistar雌鼠20只(體質量250±50 g)，雄鼠5只(體質量260±40 g)，由第三軍醫大學提供，許可證號：SCXK(渝)20120005。交配后所生48h內的新生Wistar鼠96只，隨機分為8組，分別為假手術對照組、模型組、黃芪低劑量及高劑量組、冬蟲夏草低劑量及高劑量組、聯合用藥低劑量及高劑量組，各12只。假手術組術中顯露左輸尿管后即關腹，作為對照組；余7組采用腰大肌壓迫左輸尿管上段，制作左輸尿管不全梗阻的新生鼠腎積水動物模型[4]，再隨機分為模型組及上述各干預組。對照組、模型組術后開始以生理鹽水1.0 mL/kg/d皮下注射，干預各組：黃芪低劑量及高劑量組、冬蟲夏草低劑量及高劑量組、聯合用藥(黃芪+冬蟲夏草)低劑量及高劑量組，術后相應以1 mL/kg/d、3 mL/kg/d、0.5 mL/kg/d、2 mL/kg/d、(1 mL/kg/d+0.5 mL/kg/d)、(3 mL/kg/d+2 mL/kg/d)進行皮下注射。動物在飼養3周處死，游離并切取左側腎臟，切取大小約0.5×0.4×0.3 cm3的病腎組織，置于4%的中性甲醛固定4～6 h，經脫水、浸蠟、包埋后，做病理學及免疫組化檢測；另取約50 mg腎組織，剪碎置于去RNA酶的Eppendorf(EP)管中，加入1 mL RNA-Trizol，-80 ℃保存待檢TGF-β1、IGF-1的基因表達。同時收集腎盂尿液、ELISA法檢測尿TGF-β1、IGF-1水平。

1.1.2 主要試劑 黃芪注射液購于黑龍江珍寶島藥業公司，冬蟲夏草購于廣東省中藥局，冬蟲夏草注射液：精密稱取10 g天然蟲草，粉碎置250 mL圓底燒瓶中加入50 mL蒸餾水回流煎煮3 h、過濾，反復3次，濾液濃縮至15 mL，-38 ℃真空冷凍干燥得提取物，用0.9%NS配制相應濃度[5]。RNAiso Plus(Trizol液)、TGF-β1mRNA及IGF-1mRNA引物、Prime ScriptTMRT、SYBR?Premix Ex TaqTMIID購于大連寶生物工程有限公司；兔抗鼠TGF-β1、IGF-1 一抗，山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；鼠TGF-β1、IGF-1酶聯免疫分析盒購于美國R&D公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病腎組織結構的變化 切片常規脫蠟至水，蘇木素5 min→水洗→鹽酸酒精分化數秒→水洗→伊紅液染色30 s →水洗→酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片→光鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化檢測病腎組織TGF-β1、IGF-1的表達 切片脫蠟至水，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min，pH=6.0的0.01 M檸檬酸鹽高壓鍋抗原修復2.5 min，采用PV-6001法檢測病腎組織內TGF-β1、IGF-1的表達。結果判定：在光鏡下觀察各組免疫組化切片TGF-β1、IGF-1表達情況，出現棕黃色顆粒為陽性。在400倍視野下，每張切片隨機選取5個互不重疊區域，應用Image-ProPlus(Version6.0)圖像分析軟件(IPP6.0)進行圖像分析，并測每一圖像陽性細胞的光密度(OD)，計算平均值。

1.2.3 RT-PCR法檢測病腎組織TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA的表達變化 QPCR反應。TGF-β1的上游引物：5′TGGAGCCTGGACACACAGTA3下游引物：5’CGTAGTAGACGATGGGCAGTG3’擴增長度：82 bp；IGF-1的上游引物：5’TGGCACTCTGCTTGC TCAC3’下游引物：5’GGTCCACACACGAACTGAAG3’擴增長度：140 bp，以管家基因β-actin做內參進行校正，計算TGF-β1、IGF-1的相對表達量。

1.2.4 ELISA法檢測尿TGF-β1、IGF-1的水平鼠TGF-β1、IGF-1酶聯免疫試劑盒做ELISA反應，用ELX-800型酶標儀檢測OD450值。

2 結 果

2.1 實驗動物存活 在新生鼠腎積水動物模型制作實驗期間，新生鼠96只中死亡5只，其中麻醉過深致死1只、術中死亡2只(包括腎動脈斷裂死亡1只)，術后飼養期間腹腔感染死亡2只；存活91只，存活率94.79%(91/96)。表明符合實驗動物模型的制作。

2.2 病理學檢查 大體觀：對照組雙腎等大、無積水，腎實質質地一致；模型組病腎較健腎大，包膜緊張，顏色蒼白，腎實質菲薄，腎盂擴張、積水；干預各組病腎雖仍較健腎大，但腎盂擴張、積水較模型組輕(見圖1)。梗阻近端輸尿管擴張、增粗，合并積水。鏡下觀：對照組雙腎腎小球、腎小管發育正常；模型組病腎腎小球形態怪異、失常，腎小囊、腎小管明顯擴張，腎間質纖維化重，伴不同程度炎癥反應；干預各組的病理改變較模型組輕(圖2)，隨藥物劑量增大、以及聯合用藥，病腎組織結構的損害逐漸減輕。

注：1A.對照組；1B.模型組；1C.干預組。

圖1 實驗動物左腎組織結構變化

2.3 病腎組織內TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表達 對照組腎組織TGF-β1低表達、IGF-1高表達(圖3A-B)，模型組病腎組織TGF-β1高表達、IGF-1低表達，以腎小管胞漿內出現棕褐色顆粒為陽性(圖3C-D)。干預各組TGF-β1、IGF-1均有不同程度表達(圖3E-F)。應用Image-ProPlus圖像分析軟件測量的光密度值及RT-PCR檢測TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA見表1。對照組腎組織內TGF-β1、IGF-1光密度及其mRNA與相應模型組、干預各組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，但干預各組病腎損害較模型組明顯減輕；黃芪、冬蟲夏草干預各組的低劑量與高劑量組間比較，差異也有統計學意義(P<0.05)，其中聯合用藥組優于單一用藥組。表明黃芪、冬蟲夏草可調控新生鼠病腎組織TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表達，以減輕或阻止病腎的腎損害。

注：A.對照組TGF-β1，腎小管上皮細胞弱陽性表達；B.對照組IGF-1，腎小管上皮細胞強陽性表達；C.模型組TGF-β1，左腎腎小管上皮細胞強陽性表達；D.模型組IGF-1，左腎腎小管上皮細胞弱陽性表達；E.干預組TGF-β1，左腎腎小管上皮細胞不同表達；F.干預組IGF-1，左腎腎小管上皮細胞不同表達。

圖3 實驗動物腎組織內TGF-β、IGF-1的表達

注：模型組、干預各組與對照組比較，*P<0.05； 干預各組的低劑量組與高劑量組間比較，△P<0.05。

2.4 病腎尿TGF-β1、IGF-1的水平 ELISA法檢測病腎尿TGF-β1、IGF-1水平見表2。對照組尿TGF-β1水平低、IGF-1水平高，模型組病腎尿TGF-β1水平升高、IGF-1水平降低；干預各組尿TGF-β1、IGF-1水平介于對照組與模型組之間。對照組尿TGF-β1、IGF-1水平與相應模型組、干預各組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；黃芪、冬蟲夏草干預各組的低劑量與高劑量組間比較，差異也有統計學意義(P<0.05)。

表2 實驗各組病腎腎盂尿內TGF-β1、IGF-1水平

注：模型組、干預各組與對照組比較，*P<0.05； 干預各組的低劑量組與高劑量組間比較，△P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著圍生期胎兒B超的廣泛普及應用，胎兒腎積水的檢出率逐年增多。胎兒出生后在B超的嚴密監測下，一些無癥狀、隱匿性新生兒腎積水，按1988年美國胎兒泌尿外科學會(SFU)對胎兒腎積水及新生兒腎積水的分級，其中0～Ⅱ級通常是不需要手術治療的，但需嚴密觀察，一旦病腎的分腎功能GFR(腎小球濾過率)降至15%以下，則需要手術及時干預[6]。

中成藥黃芪具有補氣升陽、益氣健脾、扶正固本以及利水消腫、補中益氣之功效[7]，它對高血壓腎病、糖尿病腎病等慢性腎臟疾病腎損害方面是有保護作用的[8]；相關研究表明中藥冬蟲夏草對慢性腎炎、腎衰竭等腎臟疾病的腎損害也具有保護作用[9]。為此，本實驗以動物模型為切入點，應用黃芪、冬蟲夏草對先天性腎積水動物模型進行皮下注射，以期觀察對先天性腎積水病腎損害有否保護作用。

本研究結果表明，黃芪、冬蟲夏草干預各組的病理改變較模型組輕，且隨藥物劑量增大、以及聯合用藥，病腎組織結構的損害逐漸減輕。說明黃芪、冬蟲夏草對先天性腎積水病腎損害具有一定的保護效應。

TGF-β1是多種細胞產生的一種致纖維化因子，其可增加細胞外基質(ECM)的合成、減少ECM的降解，具有抑制細胞的有絲分裂，促進細胞間質纖維化的生物學作用[10-13]。在慢性腎病如糖尿病腎病中，TGF-β1與其相應的受體(TGF-β1R I-Ⅲ)結合后，通過Smad蛋白在細胞核內大量轉錄、復制，促進ECM大量聚集，導致腎間質纖維化，以及引起腎小管上皮的損傷[14-16]。然而在腎臟中廣泛存在的IGF-1，其合成受生長激素(GH)、胰島素水平等的調節，應用IGF-1可減輕腎臟纖維化和腎小管的擴張等作用[17]。本研究發現，模型組病腎組織TGF-β1在腎小管上皮細胞表達升高、IGF-1表達降低，這與Seseke F等，馬洪等的結果一致[18-19]。分析原因可能是新生鼠腎積水病腎組織腎小管上皮細胞分泌TGF-β1、通過TGF-β/Smad信號通路細胞膜上TGF-β1受體進入細胞內大量轉錄、翻譯，致使病腎組織TGF-β1高表達，從而加速腎間質纖維化，導致病腎損害，致使病腎IGF-1分泌降低，IGF-1 呈低表達。應用黃芪、冬蟲夏草對UPJO新生鼠模型皮下注射后，病腎組織TGF-β1表達減低、IGF-1表達升高，腎間質纖維化減輕，且高劑量組、聯合用藥組明顯優于低劑量組及單一用藥組。究其原因可能是黃芪、冬蟲夏草阻礙TGF-β/Smad信號通路傳導，下調病腎組織TGF-β1的表達，阻止被磷酸化后的TGF-β1R I與Smad結合，抑制ECM的生成，降解腎臟纖維化的發生，減輕腎間質纖維化。此外，病腎也可能通過調節IGF-1活性的特殊蛋白(IGFBPs)之種類和數量，增強IGF-1啟動細胞傳導通路，激活IGF-1基因的正向表達，從而對病腎損害起到一定的保護作用。應用ELISA法檢測病腎尿TGF-β1、IGF-1水平表明：干預各組病腎尿TGF-β1、IGF-1水平介于對照組與模型組之間，這進一步證實黃芪、冬蟲夏草通過調控新生鼠病腎組織TGF-β1、IGF-1蛋白及轉錄水平的變化，對病腎尿也產生相似的影響。由此可見，黃芪、冬蟲夏草能在一定程度上阻止或降低病腎功能的損害，對先天性腎積水可能通過下調TGF-β1或/和上調IGF-1的表達，從而對UPJO病腎損害產生一定的保護效應。

注：A.對照組左腎腎小球、腎小管結構正常，腎小球飽滿、腎小囊無擴張；B.模型組左腎腎小球形態怪異，腎小囊及腎小管擴張，腎間質炎細胞浸潤，腎間質纖維化量；C.干預組左腎小球形態異常，腎小囊及腎小管擴張，腎間質炎細胞浸潤伴間質纖維化輕。

圖2 HE染色(HE×400)