黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco AMH基因的克隆鑒定及表達

王樂，程磊，王秋實

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco廣泛分布在我國長江、珠江和黑龍江等各大淡水域，肉質鮮美細嫩、無肌間刺，富含多種蛋白質，是一種深受消費者喜愛的淡水名優養殖對象[1,2]。黃顙魚生長速度較為緩慢，即使是在相同的養殖環境中，雄性的生長速度也遠快于雌性[3]。黃顙魚是研究性別分化及生長調控機理的典型魚類。

抗繆勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）也叫繆勒氏管抑制物（Müllerian inhibiting substance，MIS），是 β 轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一員[4]。由法國科學家Jost在1940年首次發現后，Picard等于1984年首次從初生牛犢的胚胎精巢中提取純化獲得AMH的蛋白，之后相繼在各種哺乳動物中開展相關研究[5,6]。AMH是性別分化的重要調控因子，在哺乳動物的雄性性腺分化期可以抑制繆勒氏管形成，表明AMH可能對雄性個體的精巢發育有一定作用[7]；雌性個體的AMH可阻止原卵泡的形成，降低卵泡刺激素的分泌[8]，在卵巢生理中起重要調控作用[9]。早期AMH的研究主要集中在哺乳動物和鳥類中，大部分硬骨魚沒有繆勒氏管，對魚類研究的很少。直到2002年，Miura等在日本鰻鱺Anguilla japonica中發現了一個精子誘導激素的cDNA，雖然與已獲得的AMH同源性很低，但其作用模式卻與哺乳動物及鳥類的AMH極為相似，功能分析驗證為魚類的AMH[10]。其特殊的表達模式在硬骨魚性腺發育中也起重要的調控作用。本項目組測序獲得了黃顙魚的基因組數據，并在性別分化及生長調控機理的研究方面取得了一定進展[11-13]。本試驗通過克隆黃顙魚AMH基因序列，分析該基因組織表達模式，以期為黃顙魚性別分化及生長調控機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用1、2齡黃顙魚各30尾，購買自淡水魚批發市場。采用活體快速解剖的方式收集腦、鰓、腎、肝、脾、性腺、肌肉及血液組織，迅速放入液氮中保存，隨后轉移至-80℃冰箱中，用于提取總RNA。將尾鰭樣本保存在95%酒精溶液中，用于提取DNA。

1.2 RNA提取及反轉錄

采用TRNzol Universal試劑（天根生化公司）提取樣品總RNA。取保存于-80℃的組織樣品50mg和血液300μL，加入1mLTRNzol Universal試劑，置于冰上快速勻漿完全，利用氯仿-異丙醇提取法分離純化后溶解于RNase-Free ddH2O中，DNase I（TaKaRa）純化，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，以Nanodrop8000檢測RNA純度及濃度，RNase-Free ddH2O稀釋至 50ng/μL。

本試驗的反轉錄處理包括兩種：第一種反轉錄獲得cDNA用于AMH基因開放閱讀序列的擴增。該擴增利用PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa），按說明書采用兩步法完成。第一步反應采用10μL體系，總RNA的用量為1μg，反應條件為65℃，5min；第二步反應采用相應的20μL體系，反應條件為42℃處理20min，95℃處理5min，然后進行70℃，15min的失活處理。保存于-20℃。

第二種反轉錄產物用于Real-Time PCR實驗，利用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）于冰上操作，按說明書指示完成，采用10μL體系，總RNA的用量為200ng。37℃反轉錄反應15min，85℃酶失活處理5s，-20℃保存。

1.3 DNA提取純化

剪取少量尾鰭，利用酚-氯仿抽提法純化總DNA。DNA溶解于RNase-Free ddH2O中，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以Nanodrop 8000檢測DNA的純度和濃度后，用RNase-FreeddH2O稀釋到約50ng/μL備用。

1.4 AMH基因擴增

全長序列的擴增引物設計來源于NCBI中已發布的近緣物種斑點叉尾Ictalurus punctatus的AMH 序列（XM_017477698）（表 1）。擴增反應所用模板分別為總RNA經反轉錄所得cDNA及提取純化的DNA。每個PCR反應體系為50μL，包含25μL的 2×Es Taq MasterMix（Dye）（康維世紀）、10μM的上下游引物各2μL和1μL的模板，用ddH2O補足至50μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；擴增35個循環，每個循環94℃變性30s、60℃退火60s、72℃延伸90s；72℃終延伸15min。PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Axygen膠回收試劑盒純化。純化產物連接至pMD19-T載體（TaKaRa），并轉化至DH5α感受態細胞（TaKaRa）。挑選陽性單克隆經PCR驗證后，送至金唯智生物公司測序。

表1 本研究所用的引物信息Tab.1 Primersusedinexperiment

1.5 AMH基因序列及結構分析

使用軟件BioEdit 7.0將測序所獲得AMH序列信息進行拼接整理；利用Expasy的在線工具Translate（https：//web.expasy.org/translate/）預測 AMH 基因的開放閱讀框及氨基酸序列；利用Expasy的在線工具 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）計算預測該蛋白質的理論等電點和分子量信息；用在線工 具 SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測分析信號肽序列及半胱氨酸殘基；利用軟件Clustalx 1.81進行黃顙魚AMH與其他物種AMH氨基酸間多序列比對；用cluster W軟件進行多重比對黃顙魚AMH與其他物種AMH氨基酸間同源性；利用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/）分析蛋白結構和功能。應用MEGA4.0軟件進行1 000次bootstraps值驗證，構建系統發育樹。

1.6 AMH基因的表達分析

以 SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）操作說明為指導，使用QuantStudio 6 Flex系統（Applied Biosystems）進行Real-Time PCR反應，檢測AMH基因在不同組織中的表達，Real-Time PCR的引物根據擴增產物的測序結果，在開放閱讀框內設計獲得。內參基因為黃顙魚β-actin。引物合成由金唯智生物公司完成，信息如表1所示。反應體系20μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10μL、正向引物及反向引物（10μm）各 0.4μL、ROX Reference DyeⅡ0.4mL和模板cDNA 1μL，用ddH2O補足至20μL。反應條件為標準的兩步法程序：95℃預變性10s；擴增40個循環，每個循環95℃變性5s、60℃退火34s。反應結束后，溶解曲線的反應條件為：95℃持續15s，60℃持續1min，95℃持續15s。每個樣品重復3次取均值，應用2-ΔΔCT法計算AMH基因的表達量[14]。用SPSS17.0軟件進行數據統計分析和顯著性檢驗，P＜0.05時為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 黃顙魚AMH基因序列分析

以黃顙魚總RNA反轉錄所得cDNA為模板，經克隆擴增獲得AMH基因的開放閱讀框序列，而以黃顙魚DNA為模板，經克隆擴增獲得AMH的基因組序列。將兩測序結果比對分析，確定其外顯子及內含子的組成及序列信息，獲得GenBank檢索號MK310106。

黃顙魚AMH全長3 588bp，其開放閱讀序列為1 653bp，由7段外顯子組成，可編碼550個氨基酸序列，非編碼序列包括959bp的5’-非編碼區序列（5’-UTR）、6段內含子序列及 119bp的 3’-非編碼區序列（3’-UTR）組成（圖1A）。SMART分析表明，編碼的氨基酸序列包含20個信號肽序列及9個半胱氨酸殘基，含有 AMH-N區域（87～440）及TGF-β 結構域（458～550）（圖 1B）。預測所得蛋白分子量為61.40 ku，理論pI為5.94，不穩定系數為49.66，該蛋白為不穩定蛋白。脂肪系數為85.25，親水性系數為-0.331，表明其為親水性蛋白。

2.2 AMH基因同源性分析

用Cluster W軟件進行的氨基酸序列同源性比較表明（圖2）：不同物種間的AMH氨基酸序列差異很大。本研究獲得的AMH基因序列與已發表的基因序列進行比對發現，其與黃顙魚Tachysurus fulvidraco的相似性最高，達99.6%，與低眼無齒Pangasianodon hypophthalmus及斑點叉尾的相似性也很高，分別達75.8%與74.8%，而與獅尾狒、黑猩猩等高等哺乳動物相似性最低。氨基酸序列的多重比對結果也進一步驗證了這種同源性分析結論（圖3）。這表明AMH在不同物種中的保守性并不高。

圖1 黃顙魚AMH的DNA全長序列及氨基酸序列Fig.1 The full-length DNA and deduced amino acid sequences of AMH in yellow catfish

進一步直觀研究AMH的進化特征，利用Mega4.0軟件中的NJ法繪制AMH基因的系統進化樹（圖4），所有的AMH序列都來源于硬骨魚、哺乳動物等脊椎動物，GenBank檢索信息如下：黃顙魚（MK310106）、黃顙魚 Tachysurus fulvidraco（XP_027 007942）、低眼無齒（XP_026803092）、斑點叉尾（XP_017333187）、墨西哥脂鯉Astyanax mexicanus（XP_022525495）、納氏臀點脂鯉Pygocentrus natterer（iXP_017572294）、電鰻Electrophorus electricus（XP_026873942）、安水金線鲃 Sinocyclocheilus anshuiensis （XP_016327204）、 鯉Cyprinuscarpio（XP_018920046）、斑馬魚Danio rerio（XP_009294509）、犀角金線鲃 Sinocyclocheilus rhinocerous（XP_016395808）、滇池金錢鲃 Sinocyclocheilus grahami（XP_016138462）、四川裂腹魚Schizothorax kozlovi（ASU44862）、 北 極 紅 點 鮭Salvelinus alpinus（XP_023855208）、鯽 Carassius auratus（AHL68989）、核雅羅魚 Squalius pyrenaicus（ABX55992）、黑鯽 Carassius gibelio（AKP99417）、虹鱒 Oncorhynchus mykiss（XP_021459508）、浪白魚Anabarilius graham（iROL40795）、大鱗大麻哈魚Oncorhynchus tshawytscha（XP_024277327）、大西洋鮭Salmo salar（ADJ38820）、Seriolalalandi dorsalis（XP_023263819）、人 Homo sapiens（EAW69397）、黑猩猩 Pan troglodytes（XP_016790129）、獅尾狒Theropithecus gelada（XP_025222375）。分析結果如圖4所示，除一種Seriola lalandi dorsalis進化地位比較特殊外，所有的AMH均可為兩個大分支：哺乳動物為一支，其他魚類為另一支。黃顙魚AMH先與斑點叉尾、低眼無齒等鯰形目物種聚集成簇，再與電鰻、納氏臀點脂鯉等聚類。

圖2 黃顙魚AMH同其他脊椎動物AMH氨基酸同源性比較Fig.2 Comparative homology of the amino acid sequences of yellow catfish AMH with other vertebrate AMH

2.3 黃顙魚AMH基因的mRNA表達

Real-Time PCR檢測AMH基因在不同生長階段黃顙魚的腦、鰓、腎、肝、脾、性腺、肌肉及血液中的表達情況（圖5）。結果表明，AMH基因的mRNA在不同組織中的表達水平差異很大。1齡雄魚各組織的表達量顯著高于1齡雌魚，尤其是性腺、肝、腎中，雄性表達量遠遠高于雌性，只有在脾中，雄性表達量略低于雌性；2齡魚中，AMH基因的表達量僅雄性的性腺、脾中顯著高于雌性，而在雄性腦和血液中表達量又明顯低于雌性，在其他的組織中的表達基本相似。

3 討論

Miura等（2002）在日本鰻鱺中發現了第一個魚類的AMH基因，隨后在大西洋鮭Salmo salar、日本青鰈 Paralichthys olivaceus、斑馬魚 Danio rerio、青Oryzias latipes、奧利亞羅非魚Oreochromis aurea等魚類中相繼開展了AMH的克隆研究工作[10]。

本研究首次擴增獲得了黃顙魚的AMH基因，全長3 588bp，其開放閱讀序列為1 653bp，可編碼550個氨基酸序列。測序結果經比對分析，與本項目組前期測序獲得的黃顙魚基因組上部分信息完全一致。BLAST分析將本研究擴增獲得的AMH基因定位于基因組序列2號染色體chr2的19371164～19374761區間。SMART分析表明，黃顙魚AMH基因編碼蛋白含有典型的AMH-N區域及TGF-β結構域。AMH-N結構域上的糖基化位點及TGF-β結構域上含有的特異性裂解位點，可有助于AMH形成蛋白二聚體，同時含有9個保守的半胖氨酸殘基，這與之前的研究結論相一致，經驗證該蛋白屬于TGF-β超家族[15]。

圖3 預測的黃顙魚AMH氨基酸序列及與其他魚類AMH氨基酸序列的比較。Fig.3 Predicted amino acid sequence of yellow catfish AMH and alignment with other teleost

起初關于AMH表達的研究主要集中在性腺組本研究初步對黃顙魚的AMH進行了克隆分離與鑒定析，但其對性別分化及發育的調控作用還有待進一步研究?？?，這是因為AMH在性別分化及發育中起重要的調控作用。后來的研究表明，AMH在斑馬魚的腦、肌肉、眼、皮膚、腎、肝和心等組織中都有表達[16]。本研究中黃顙魚AMH的mRNA在腦、肌肉、肝等所檢測的組織中均有表達且存在著極大的差異性。這與Rodríguez-Marí等（2005）對斑馬魚中 AMH 的表達結果相類似[17]。1齡雄魚性腺中的表達量顯著高于2齡雄魚，這是因為黃顙魚精巢分化大致始于孵出后55d。在性腺分化時期，與性別分化相關的基因處于較活躍狀態，促進了AMH的表達。而在性成熟時期，精母細胞和雄性激素的協同作用又有效抑制了AMH表達[18]。該檢測結果表明：AMH極可能在黃顙魚的性別分化及生長發育過程中都發揮重要作用。

圖4 NJ法構建黃顙魚AMH與其他脊椎動物AMH系統樹Fig.4 Phylogenetic tree of yellow catfish AMH and other species AMH based on the Neighbor-joining method

圖5 AMH基因mRNA在黃顙魚各組織中的表達水平Fig.5 mRNA expression level of AMH gene in different tissues of yellow catfish