HPLC-MS/MS法檢測(cè)血漿伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度的方法建立及在白血病患者用藥監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用*

王 磊，孫文利，劉 瑞，王紅春，劉紅星，2

(1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院，河北三河 065201，2.北京陸道培血液病研究院，北京 100176)

關(guān)鍵字：伏立康唑；泊沙康唑；伊曲康唑；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；治療藥物監(jiān)測(cè)

白血病是一類(lèi)造血干細(xì)胞的克隆性惡性疾病，免疫功能低下的患者容易受到真菌感染的侵襲[1-3]，而唑類(lèi)抗真菌化合物[1-13](如伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑)在預(yù)防和治療這些真菌感染方面占有堅(jiān)實(shí)的地位。伏立康唑主要用于治療侵襲性曲霉菌病或抗氟康唑念珠菌感染。泊沙康唑亦用于治療真菌感染或侵襲性曲霉菌病的搶救治療[6]。伊曲康唑?qū)η咕湍钪榫哂谢钚裕陬A(yù)防真菌感染方面具有一定的地位。唑類(lèi)抗真菌藥[4-11]的藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出較大的個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)變異，部分原因可由非線性藥動(dòng)學(xué)、生物利用度差異、藥物相互作用和細(xì)胞色素P450多態(tài)性所致。多年來(lái)，這種變異一直困惑著臨床。近期，有研究顯示患者血漿中唑類(lèi)藥物濃度與療效和毒性之間有一定相關(guān)性[5-13]。為了常規(guī)監(jiān)測(cè)血漿中唑類(lèi)抗真菌藥物的含量，需要一種通用的高通量樣品分析方法。目前尚無(wú)關(guān)于伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑商品化的血藥濃度檢測(cè)試劑盒。因此，我們建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈活的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析患者血漿中此三種藥物的濃度，通過(guò)血藥濃度檢測(cè)以解決臨床在使用這三種藥物時(shí)所面臨的困境，讓臨床能更直觀的調(diào)整患者給藥劑量，達(dá)到更好地治療效果。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 由于筆者所在醫(yī)院為血液病醫(yī)院，移植患者口服伏立康唑和泊沙康唑較多，故收集近期服用伏立康唑和泊沙康唑患者血漿樣本各1 000份，伊曲康唑患者血漿樣本3例；標(biāo)本采集時(shí)間均為下次服藥前，采集靜脈血2 ml，混勻，EDTA抗凝。室溫(20～25℃)下標(biāo)本存放時(shí)間不超過(guò)4 h，當(dāng)日進(jìn)行HPLC-MS/MS法檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器 色譜甲醇(fisher)，水(廣州屈臣氏)；甲酸(HPLC Grade，MREDA TECHNOLOGY INC)；乙酸銨(HPLC Grade，MREDA TECHNOLOGY INC)；伏立康唑(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；伏立康唑-d3，泊沙康唑，泊沙康唑-d4，伊曲康唑和伊曲康唑-d9均來(lái)自TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC(HPLC Grade)。高效液相色譜系統(tǒng)(SHIMADZU，含二元LC-AD XR高壓輸液泵，DGU-20A3在線脫氣機(jī)，CTO-20A柱溫箱，SIL-20ACXR自動(dòng)進(jìn)樣器)；質(zhì)譜(AB Sciex 4000Qtrap)；數(shù)據(jù)分析處理軟件：Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件：見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件

注：DP：declustering potential；CE：collision energy；CXP：collision cell exit potential；EP：entrance potential。

色譜條件：采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6×50 mm，5 μm)，柱溫60℃；流速：0.8 ml/min；流動(dòng)相：0.1 ml/dl甲酸甲醇溶液(A)- 0.1 ml/dl甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液(B)，進(jìn)樣量1 μl，洗脫方式：梯度洗脫，其中0.3～1.3 min，A相濃度為12%～82.5%，保持1.2～2.6min A相濃度從82.5%～100%，保持0.9～3.6min A相濃度從100%～12%，保持1.4 min停止。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子模式；監(jiān)測(cè)模式為MRM；離子噴射電壓：4 500 V；溫度：500℃；GS1：55；GS2：55；Curtain gas：30；碰撞氣壓力：Medium。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液與內(nèi)標(biāo)貯備液的配制：精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑各10 000 0 mg，分別置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10.00 ml容量瓶中，用甲醇定容，得1.0 mg/ml伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)品母液，作為貯備液。分別移取各標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，混合，再用甲醇-超純水(1/1)依次稀釋?zhuān)謩e得混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1，5，10，25，50，75和100 μg/ml，作為1～7號(hào)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品伏立康唑-d3 0.5000 mg，泊沙康唑-d4 0.5000 mg和伊曲康唑-d9 1.000 0 mg分別置于三個(gè)小燒杯中，用適量甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至三個(gè)10.00 ml容量瓶中，用甲醇定容，得50 μg/ml 伏立康唑-d3母液，50 μg/ml 泊沙康唑-d4和100 μg/ml 伊曲康唑-d9母液作為內(nèi)標(biāo)貯備液，分別移取各內(nèi)標(biāo)貯備液適量，配成濃度為伏立康唑-d3 5 ng/ml，泊沙康唑-d4 100 ng/ml和伊曲康唑-d9 200 ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)液，備用。

1.3.3 樣品處理方法：移取患者樣本血漿100 μl置于1.5 ml EP管中，然后加入0.1 ml/dl甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液100 μl，渦旋振蕩0.5 min，再加入混合內(nèi)標(biāo)液800 μl，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min，離心10 min，取上清液150 μl置于自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別在7個(gè)1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑各系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μl，得各標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.1，0.5，1，2.5，5，7.5和10μg/ml，按“1.3.3”項(xiàng)下樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，分別以伏立康唑峰面積/伏立康唑-d3峰面積為(Y)對(duì)伏立康唑濃度(X)，泊沙康唑峰面積/泊沙康唑-d4峰面積為(Y)對(duì)泊沙康唑濃度(X)和伊曲康唑峰面積/伊曲康唑-d9峰面積為(Y)對(duì)伊曲康唑濃度(X)進(jìn)行線性回歸，分別得伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 回收率、精密度試驗(yàn)：分別在3個(gè)1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑2，3，5號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液各10 μl，得各標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.5，1和5 μg/ml，按“1.3.3”項(xiàng)下樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，各濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)回收率及日內(nèi)精密度，并連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算日間精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別在3個(gè)1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑2，3，5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)工作液各10 μl，得各標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.5，1和5 μg/ml。取一份樣品按“1.3.3”項(xiàng)下血樣處理方法處理后置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，于放置時(shí)間72 h分別測(cè)定各樣品的濃度；其余樣品于4℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，按“1.3.3”項(xiàng)下樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)伏立康唑和泊沙康唑血藥濃度檢測(cè)結(jié)果作四分位法分析。

2結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜行為 在“1.3.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件下，測(cè)得伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖1；其質(zhì)譜色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，血中沒(méi)有物質(zhì)干擾伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的測(cè)定，出峰時(shí)間分別是2.61，2.87和3.35 min；各物質(zhì)能實(shí)現(xiàn)較好分析，各峰型良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 在“1.3.4”條件下，伏立康唑回歸方程為：Y=1.58X+0.011 6 (r=0.998 7)，泊沙康唑回歸方程為：Y=1.38X+0.021 7(r=0.998 2)和伊曲康唑回歸方程：Y=1.42X+0.032 5(r=0.999 1)，表明此三種物質(zhì)在濃度0.1～10.0 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系均較好，可用于血漿中此三種藥物的含量測(cè)定，最低定量限分別為0.009，0.021和0.085 μg/ml。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果 伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的相對(duì)回收率和日內(nèi)、日間精密度測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。由表2可知，伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑相對(duì)回收率均在±5%之間，日內(nèi)及日間精密度RSD均小于5%。說(shuō)明此方法檢測(cè)血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度精密度和準(zhǔn)確度較好。

表2 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

伏立康唑(A)，伏立康唑-d3(B)，泊沙康唑(C)，泊沙康唑-d4(D)，伊曲康唑(E)和伊曲康唑-d9(F)。

圖2 伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑質(zhì)譜色譜圖

2.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果 見(jiàn)表3。在4℃條件下，血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑放置72 h濃度無(wú)變化；血樣經(jīng)過(guò)處理后，在4℃條件下，放置72 h，伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度亦無(wú)變化。說(shuō)明伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑在血中較穩(wěn)定，同時(shí)血漿樣本經(jīng)前處理后不會(huì)影響其穩(wěn)定性，可長(zhǎng)時(shí)間放置，待檢。由此可知，在此條件下測(cè)定血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度，穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用結(jié)果 白血病患者伏立康唑和泊沙康唑血藥濃度檢測(cè)結(jié)果做成箱式圖，可以得知1 000例伏立康唑樣本濃度檢測(cè)結(jié)果中位數(shù)是0.8 μg/ml，上四分位數(shù)是0.3 μg/ml，下四分位數(shù)是1.7 μg/ml，伏立康唑 0.1～10 μg/ml的檢測(cè)范圍符合臨床需求。1 000例泊沙康唑樣本濃度檢測(cè)結(jié)果的中位數(shù)是0.8 μg/ml，上四分位數(shù)是0.4 μg/ml，下四分位數(shù)是1.4 μg/ml，與泊沙康唑 0.1～10 μg/ml的檢測(cè)范圍相符合。

3討論本實(shí)驗(yàn)采用混合內(nèi)標(biāo)法，通過(guò)蛋白沉淀法進(jìn)行甲醇沉淀蛋白和釋放伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑，使其充分溶解于甲醇。通過(guò)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行快速檢測(cè)，進(jìn)而實(shí)時(shí)定量，能節(jié)約各藥物的定標(biāo)時(shí)間和檢測(cè)各樣本平衡時(shí)間，能快速報(bào)告各藥物血藥濃度，輔助臨床盡早調(diào)整用藥，使患者得到適宜的個(gè)體化治療。

此1 000例伏立康唑血藥濃度檢測(cè)結(jié)果表明目前使用伏立康唑劑量偏小，濃度偏低，明顯低于伏立康唑有效谷濃度范圍0.5～5μg/ml[1-13]，說(shuō)明白血病患者服用伏立康唑尚有一部分患者不能達(dá)到有效的預(yù)防和治療濃度，對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)具有重要的臨床意義。而1 000例泊沙康唑血藥濃度檢測(cè)結(jié)果表明目前使用泊沙康唑的劑量也較低，血藥濃度結(jié)果偏低，亦小于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[1-13]的有效谷濃度(>0.7 μg/ml)，其檢測(cè)結(jié)果中位數(shù)明顯低于理想靶值(1.25 μg/ml)，說(shuō)明白血病患者在目前臨床給藥情況下，有相當(dāng)一部分患者未能達(dá)到有效的治療濃度，足見(jiàn)對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)能更好地使患者得到治療，有效控制感染和避免感染的發(fā)生。而伊曲康唑目前臨床應(yīng)用較少，3例檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，伊曲康唑在目前臨床給藥情況下，其血藥濃度尚可，其主要代謝產(chǎn)物羥基伊曲康唑[3-9]與原藥伊曲康唑的濃度比例為2∶1，且羥基伊曲康唑體外研究表明還有活性，體內(nèi)研究尚無(wú)完整數(shù)據(jù)可查。

目前國(guó)內(nèi)[3-7]對(duì)于抗真菌藥物的治療藥物監(jiān)測(cè)已經(jīng)有一些共識(shí)和具體建議，越來(lái)越多的國(guó)外[11-13]研究結(jié)果認(rèn)為血漿藥物濃度監(jiān)測(cè)在抗真菌藥物的安全性和有效性?xún)?yōu)化方面起到重要的作用；美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(IDSA)關(guān)于曲霉菌病治療的臨床實(shí)踐指南中，建議結(jié)合血漿抗真菌藥物濃度和其他臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)評(píng)估藥物暴露不足導(dǎo)致的治療失敗以及藥物毒性。