PCR-HRM方法分析16S rRNA基因進行細菌鑒定的可行性研究*

邱會茹，王佳琳，薛文成，楊 婧，任 微

(1.錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧錦州 121000；2.北部戰區總醫院a.檢驗科；b.感染控制科，沈陽 110016)

目前臨床上引起感染的病原菌種類繁多，傳統表型等鑒定方法已不足以滿足細菌感染性疾病臨床診斷的需要。操作簡單、準確的診斷方法對于病原菌的早期鑒定十分重要[1]。一個快速、可靠的診斷平臺，可以提供廣泛的病原菌篩查和特定的感染性細菌鑒定，對于實現感染性疾病的早期診斷、科學指導患者進行個體化抗生素治療具有重大意義[2-3]。

近年來，PCR擴增產物的高分辨熔解曲線(HRM)分析技術有望為臨床常見感染菌的鑒定提供一種快速、經濟的鑒定方法[4]。目前，16S rRNA不同結構域在細菌鑒定中的功能已得到明確分析和廣泛認可，已有多篇研究報道16S rRNA可用于鑒定臨床分離菌[5]。本文對基于16S rRNA基因進行HRM分析鑒定細菌的可行性進行研究，以實現常見臨床感染菌的早期診斷及治療。

1材料和方法

1.1 菌株來源 收集中國人民解放軍北部戰區總醫院2017年8月～2018年10月期間臨床分離的167株常見細菌(同一患者同一部位相同細菌做一次計數)，菌株標本類型分布：尿液68株，痰49株，血液30株，引流液13株和導管7株。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213，銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922，均購于國家衛健委臨床檢驗中心。

1.2 試劑與儀器 Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，Light Cycler 480 High Resolution Melting Master PCR擴增試劑盒(瑞士羅氏公司)，3對擴增引物(上海生工生物工程有限公司)，Roche LightCycler480 PCR定量分析儀(瑞士羅氏診斷公司)；Bruker MicroflexTMMALDI-TOP MS質譜鑒定儀(德國布魯克公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取：使用MALDI-TOF MS對臨床分離菌株進行鑒定，分純菌落并傳代培養以獲取遺傳性狀穩定的純菌落。挑取血瓊脂培養基上5～8個菌落加入盛有1.5 ml去離子水的EP管中，配置菌懸液。采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌DNA，并將DNA液濃度標準化至20～40 ng/μl備用。

1.3.2 PCR擴增及HRM分析：所用引物參照文獻[6]設計，并進行BLAST(http：//www.nc-bi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)序列比對以驗證引物特異性[7]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

采用含有飽和熒光染料的Roche LightCycler 480 High Resolution Melting Master PCR擴增試劑盒(羅氏診斷公司)配制20 μl的PCR-HRM反應體系：Master mix 10 μl，MgCl22.4 μl，三對F/R引物各0.5 μl，模板DNA 1 μl，H2O 3.6 μl。利用Roche Light Cycler480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)進行PCR-HRM實驗，反應程序為：①預變性95℃ 1 min；②PCR反應：變性95℃ 30 s，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共40個循環反應；③擴增產物HRM測定：95℃ 1 min，28℃ 1min，60℃～95℃升溫變性，溫度變化速率為0.03℃/s；④HRM分析：采用HRM基因掃描分析軟件分析所有樣本熔解曲線。

表1 實驗所需引物序列

1.3.3 167株臨床常見菌PCR-HRM分析方法的應用：通過預實驗獲得最佳反應條件以進行167株臨床常見細菌PCR-HRM實驗。將分離的167株細菌分為葡萄球菌、鏈球菌、非發酵陰性桿菌以及其它臨床常見分離菌四組進行實驗，探討該實驗方法對臨床常見細菌的鑒別能力。

1.3.4 靈敏度檢測：選取2株肺炎克雷伯菌DNA模板，將濃度調至20 ng/μl，采用10×倍比稀釋法得到20 ng/μl～2 fg/μl的8個DNA模板濃度進行HRM實時熒光定量PCR檢測。

1.3.5 PCR-HRM重復性實驗：隨機選取6株革蘭陰性菌，一式三份，在相同條件下與陰性對照同時進行PCR-HRM檢測，以此結果分析該方法的可重復性。

1.3.6 常見臨床感染細菌盲法驗證試驗：將2種臨床常見標準菌株、24株臨床隨機分離的細菌基因組DNA濃度調至20～40 ng/μl，取DNA模板1 μl進行PCR-HRM以進行盲法驗證試驗。

1.3.7 測序：以MALDI-TOF MS和PCR-HRM對臨床分離菌株鑒定結果進行對比，對結果不一致的細菌測序，并將測序峰圖與GenBank BLAST數據庫進行比對，以確定臨床分離菌株的菌種。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22軟件對MALDI-TOF MS和PCR-HRM兩種方法進行統計分析，分型方法采用配對四格表的χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 使用MALDI-TOF MS對167株臨床分離菌株進行鑒定 其中有118株評分>2分，42株質譜評分在1.8～2.0之間，7株細菌評分<1.8。對PCR-HRM和MALDI-TOF MS鑒定結果進行對比，將結果不一致的PCR產物送去上海生工生物工程有限公司測序。以測序結果為金標準，MALDI-TOF MS與PCR-HRM鑒定結果，見表2。

表2 MALDI-TOF MS和PCR-HRM對臨床 分離的167株實驗菌進行鑒定結果對比

注：1.PCR-HRM鑒定正確：多菌株同類聚為區別于其它菌種的一類；單獨一株有區別于其它菌株，尤其是革蘭染色相同或種屬相近菌株的單獨特征曲線。PCR-HRM鑒定錯誤：未和已知(測序確定，或標準菌株，或同種菌株中的多數)聚為同類。2.采用SPSS 22軟件計算后顯示PCR-HRM與MALDI-TOF MS鑒定結果差異無統計學意義(χ2=1.97，P=0.727>0.05)。

實驗結果顯示該實驗方法可區分金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌，甚至可將凝固酶陰性葡萄球菌區分到種級，見圖1。對于鏈球菌、非發酵陰性桿菌以及其它常見臨床分離菌，PCR-HRM方法可將細菌區分至屬級，并且大部分臨床感染菌可區分至種級。

2.2 靈敏度檢測 采用10×倍比稀釋法得到20 ng/μl～2 fg/μl的8個DNA模板濃度，進行PCR-HRM分析測定其靈敏度。圖3所示，DNA模板濃度在20 ng/μl～2 pg/μl范圍可獲得特征性熔解曲線，200 fg/μl～2 fg/μl濃度與陰性對照結果聚類，結果顯示該實驗方法可檢測到2 pg/μl濃度的DNA模板。

2.3 重復性實驗 隨機選取6株革蘭陰性菌，一式三份，在相同條件下與陰性對照同時進行PCR-HRM檢測。6株實驗菌3份的重復性結果完全一致，見圖4，證明該實驗重復性良好。

2.4 常見臨床感染細菌盲法驗證試驗 見圖5。常見臨床感染細菌PCR-HRM盲法驗證試驗結果顯示，24株臨床分離感染細菌與2株標準菌株均產生特征性熔解曲線。根據標準菌株產生的擴增曲線，可成功鑒別出5株金黃色葡萄球菌和3株大腸埃希菌。其它16株細菌均經MALDI-TOF MS鑒定，分別為5株鮑曼不動桿菌、3株人葡萄球菌、3株屎腸球菌、3株黏質沙雷菌、2株洋蔥伯克霍爾德菌，評分均>1.8，PCR-HRM盲法驗證試驗結果與MALDI-TOF MS鑒定結果一致。

3討論人體常見致病菌種類繁多，如葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌與變形桿菌等，許多臨床常見病原菌以其能夠產生廣泛的耐藥性而聞名，其中最常見的是“ESKAPE”病原菌(腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬)[8]。雖然常見致病菌感染后的臨床表現相似，但最佳的治療方案取決于致病菌的種類。通常，用于經驗性治療可疑細菌感染的第三代頭孢菌素和呋喃喹諾酮類藥物對銅綠假單胞菌感染沒有作用；鮑曼不動桿菌對頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素耐藥；大腸埃希菌和克雷伯氏菌等腸桿菌有著廣泛的耐藥基因，需要進一步檢測以確定其藥敏。因此，病原菌種類的鑒定可引起治療方案的改變，對科學指導患者進行個體化抗生素治療有著重要意義[9-10]。

在我國臨床診斷實驗室中，菌種鑒定通常基于傳統培養技術，這種方法可能需要8～120 h。然后經革蘭染色顯微鏡觀察，將分離出的病原菌分為革蘭陰性或革蘭陽性兩種，并利用選擇性培養基和生化試驗進一步鑒定。二次培養步驟通常需要8～48 h，利用生化鑒定板(如API20E腸道菌試劑鑒定條)鑒定需要24 h的孵育[11]。

圖1 臨床常見葡萄球菌熔解曲線圖

圖2 臨床常見鏈球菌熔解曲線圖

圖3 PCR-HRM靈敏度檢測結果

圖4 PCR-HRM重復性試驗熔解曲線結果

圖5 臨床分離24株感染細菌與2株標準菌株的盲法驗證曲線圖

近年來，分子檢測技術已用于細菌種類的鑒定，這種方法提供的結果比傳統鑒定更快速。已有研究表明快速分子檢測的運用縮短了最佳治療時間和病原菌感染者的出院時間。16S rRNA序列測定可用于細菌鑒定，但成本高、耗時長、臨床應用有限[12]。其它可提供高度復用性的細菌檢測方法，如FilmArray血培養鑒定組合(Biofre Diagnotics，美國)和Verigene革蘭陰性血培養分析(Nansphere，美國)可以在樣本初始培養陽性后2 h內提供結果，但這些檢測方法不僅費用昂貴，還需要專門的儀器檢測。

本研究的目的是建立一種基于HRM分析鑒別臨床常見感染細菌的檢測方法，通過使用3對細菌高覆蓋度的16S rRNA引物構造多重差異曲線對細菌進行分類，為培養初期病原菌的快速鑒定提供依據[13]。在PCR反應后，反應以0.1℃遞增加熱，熒光信號則由實時PCR系統監測。擴增產物在熔解溫度下進行解離釋放飽和染料，導致熒光信號改變，通過捕獲熒光信號產生特征性熒光曲線，對臨床常見病原菌進行鑒別。PCR-HRM分析可提供一種快速、簡單、低成本、封閉的擴增分析方法，具有單核苷酸識別能力[14]，并且有較高的靈敏度、特異度與可重復性[15]。這種方法大大降低了臨床常見病原菌對DNA測序的需求與鑒定成本。

該分子診斷方法存在的一個局限性是無法通過標準曲線對細菌進行量化。由于飽和染料的非特異性，任何擴增產物都能產生熒光，多個目標可能同時被放大，使定量不可靠。這種方法的另一個缺點是，擴增區域內具有相同序列的、親緣關系密切的菌種不容易被區分，所以應用這項技術進行親緣關系較近的細菌鑒定時應設計特異度較強的引物。預測這項鑒定方法將成為鑒別臨床常見感染菌有用的診斷工具，它不僅可快速檢測實驗結果，其成本與傳統檢測方法相比也更低。但這種鑒定方法的推廣需要進行更多樣本的驗證，以便更準確地確定其性能。此外，該方法可指導臨床個體化用藥治療，我們可以進行一項實驗研究，以衡量快速檢測病原菌在抗生素個體化治療方面的臨床意義。

綜上所述，該方法通過使用3對16S rRNA引物構造多重HRM曲線可對臨床常見細菌進行分類到屬級甚至種級，且靈敏度高、特異度強，可以作為鑒定臨床常見感染菌的新選擇。