甘肅省天水地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌致尿路感染的基因分型及耐藥性分析*

楊宏斌，張 妍

(天水市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，甘肅天水 741000)

尿路感染又稱泌尿系統(tǒng)感染，是由各種病原體入侵泌尿系統(tǒng)引起的疾病，根據(jù)有無梗阻、結(jié)石、畸形、膀胱輸尿管反流等尿路異常情況分為復(fù)雜性和非復(fù)雜性尿路感染[1]。大腸埃希菌是引起尿路感染的最常見病原菌，國內(nèi)復(fù)雜性尿路感染細菌譜的特點是大腸埃希菌感染比例降低，而產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrump-beta-lactamases，ESBLs)大腸埃希菌菌株比例升高，且各地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型分布有一定差異[2]。本研究收集2017年1月～2018年10月住院患者尿培養(yǎng)分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌1 003株，通過檢測ESBLs基因型和藥物敏感性試驗分析，了解本地區(qū)尿路感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥基因型流行性及耐藥現(xiàn)狀，從而為指導(dǎo)臨床用藥和院內(nèi)感染的防控提供參考。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集我院2017年1月～2018年10月尿路感染患者非重復(fù)分離的尿培養(yǎng)大腸埃希菌2 126株，其中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株1 003株。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：嚴格按《尿路感染臨床微生物實驗室診斷》2016標(biāo)準(zhǔn)要求，選取尿路感染患者中段尿進行培養(yǎng)，菌落計數(shù)(CFU)≥105cfu/ml判斷為尿路感染病例。

1.2 儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司提供)；ABI7500實時熒光PCR儀(美國ABI公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；Taqdna聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；bio-rad電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國bio-rad公司)。K-B法藥敏紙片購自溫州康泰生物公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥物敏感性試驗：嚴格按《尿路感染臨床微生物實驗室診斷》2016標(biāo)準(zhǔn)進行細菌培養(yǎng)和分純，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)進行鑒定，藥物敏感性試驗采用K-B法測定各種抗生素的抑菌圈直徑。結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI 2017)標(biāo)準(zhǔn)判讀[3]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。使用WHONET5.6對目的菌株進行藥物敏感性分析。

1.3.2 ESBLs表型檢測：按照CLSI2017推薦的雙紙片協(xié)同法進行表型確證試驗，即采用頭孢噻肟及頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶及頭孢他啶/克拉維酸兩組紙片進行試驗，加克拉維酸比不加克拉維酸抑菌環(huán)直徑≥5 mm時，判定為產(chǎn)ESBLs菌株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC70063分別作為ESBLs確證試驗的陰性和陽性質(zhì)控菌株。

1.3.3 ESBLs基因型檢測：采用改良堿裂解法[4]提取細菌質(zhì)?？侱NA，取2 μl提取物作為模板，多重PCR檢測blaTEM，blaCTX-M，blaSHV，blaOXA，blaCTX-M-14，bla CTX-M-15和blaCTX-M-3基因型，使用引物序列見表1。反應(yīng)體系25 μl，ESBLs基因擴增條件：95℃預(yù)變性3 min，變性95℃30 s，退火56℃30 s，延伸70℃40 s，32個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物1 g/dl的瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，在紫外線下觀察產(chǎn)物片段。

表1 耐藥基因引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用χ2檢驗和Fisher確切概率法；藥敏試驗數(shù)據(jù)運用WHONET5.6進行處理分析。

2結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分布情況 本研究收集尿路感染患者尿培養(yǎng)大腸埃希菌2 126株，經(jīng)確證試驗證實產(chǎn)ESBLs 菌株1 003株，產(chǎn)酶率47.2%。科室分布特點：泌尿外科檢出475株，占47.4%，內(nèi)分泌科(糖尿病患者為主)檢出216株，占21.5%，神經(jīng)外科檢出105株，占10.5%，腫瘤科檢出81株，占8.1%，婦產(chǎn)科檢出69株，占6.9%，急診科檢出55株，占5.5%，其他科室檢出2株占0.2%。

2.2 細菌敏感性分析 與非產(chǎn)酶株比較，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對于青霉素類、1～3代頭孢菌素、單環(huán)類、氟喹諾酮類、磺胺類的耐藥率均超過80%，僅對亞胺培南、美羅培南、磷霉素和呋喃妥因的耐藥率小于5%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；具體藥物敏感性分析結(jié)果見表2。

表2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率分析[n(%)]

注：*示Fisher’s精確概率。

2.3 基因型分布特點 對1 003株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株的耐藥基因型檢測，結(jié)果blaCTX-M基因624株、bla-TEM型287株、bla-SHV型51株、bla-OXA型30株，7株同時攜帶2種不同耐藥基因。部分基因型PCR擴增電泳結(jié)果見表3、圖1。

2.4 攜帶不同耐藥基因模式與細菌耐藥性的分析 1 003株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌攜帶1種基因型的單一模式624株，同時攜帶2種不同基因型的復(fù)合模式7株。分析復(fù)合模式blaCTX-M-14+ bla-TEM型、blaCTX-M-15+ bla-TEM型和blaCTX-M-3+ bla-TEM型對頭孢他啶耐藥率分別為57.1%(4/7)，28.5%(2/7)和14.2%(1/7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.73，P<0.01)。

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因型分布情況

M：Marker；1～2：CTX型；3～4：TEM型；5：SHV型；6：OXA型。

3討論大腸埃希菌是引起臨床各種感染性疾病的重要病原菌，以泌尿系統(tǒng)感染為主，由其入侵尿道導(dǎo)致的尿路感染影響了全球超過1.5億人口，其高復(fù)發(fā)率和日趨嚴重的抗生素抵抗正成為社會公共衛(wèi)生的重大負擔(dān)[5]。2017年全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)結(jié)果調(diào)查表明，大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)酶率為52.2%，本研究顯示，天水地區(qū)近2年產(chǎn)酶率為47.2%，略低于全國平均水平[6]，這與國家對抗生素管理的不斷加強及臨床對細菌耐藥性的認識水平提高有關(guān)。

尿路感染以其嚴重的后遺癥(包括腎盂腎炎膿毒癥、嬰幼兒腎損害和早產(chǎn)等)成為威脅新生兒、老年人和婦女等人群健康的主要疾病之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌致尿路感染首位發(fā)生于泌尿外科，其次為內(nèi)分泌科和神經(jīng)外科。分析可能原因，大部分病例有長期留置導(dǎo)尿管、中心靜脈置管、體外碎石術(shù)、腎移植術(shù)、腦室-腹腔分流術(shù)等有創(chuàng)操作，部分病例存在糖尿病、自身免疫病、高齡患者等的基礎(chǔ)疾病，其機制為臨床侵入性操作損傷了機體的黏膜屏障作用，使腸道菌群發(fā)生了明顯異位，伴隨患者組織修復(fù)能力減弱及代謝改變，造成機體對病原菌的感染防御功能減低，促使多重耐藥菌的感染與傳播，這與嚴海忠等[7]人報道一致。

本研究對天水地區(qū)大腸埃希菌尿路感染的耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對19種臨床抗生素的耐藥率都高于非產(chǎn)酶組，對亞胺培南、美羅培南、磷霉素和呋喃妥因耐藥率分別為1.1%，0.9%，4.4%和2.6%，2018年CNINET上半年數(shù)據(jù)顯示，大腸埃希菌對碳青霉烯類的耐藥率為1.5%，對磷霉素和呋喃妥因的耐藥率分別為5.2%和3.6%，與本研究結(jié)果相符。這提示臨床，對于急性單純性下尿路感染的輕癥患者，建議應(yīng)用口服磷霉素氨丁三醇或呋喃妥因治療，并適用于尿路感染的維持治療或降階序貫治療[8]。但對于有急危重癥及放化療尿路感染患者，建議首選碳青霉烯類治療[9]。因此，對于產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌引起的尿路感染患者的管理，除根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果選擇有效抗生素種類外，還需加強床旁的隔離防護措施，避免耐藥菌的水平傳播。

由質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs酶是大腸埃希菌重要耐藥機制，目前全世界共發(fā)現(xiàn)了200多種ESBLs，根據(jù)編碼基因的同源性分為blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaOXA和其他共5大類型[10]。近年來，大腸埃希菌致尿路感染臨床治療現(xiàn)狀為，對復(fù)雜性尿路感染患者在獲得藥敏試驗結(jié)果之前經(jīng)常采用經(jīng)驗性治療或不規(guī)范的抗生素治療，導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。CHINET耐藥監(jiān)測網(wǎng)和全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CRASS)的數(shù)據(jù)顯示，近8年來我國大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs發(fā)生率在50%～60%，基因型90% 以上為CTX-M型，由于我國人群地域分布特點不同及抗生素的個體化差異，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株的耐藥基因表型流行特征也不盡相同[2]。本研究顯示，天水地區(qū)產(chǎn)ESBLS大腸埃希菌耐藥基因型以 blaCTX-M-14表型為主，其次為blaTEM表型，blaSHV和blaOXA表型小于10%，這與徐學(xué)靜等[11]報道一致，而與周杰等[12-13]報道的blaCTX-M亞型有差別，可能與地域差異及臨床用藥習(xí)慣有關(guān)[14]。本研究首次分析了產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌不同攜帶模式菌株對頭孢他啶的耐藥率，結(jié)果顯示，攜帶blaCTX-M-14型及blaCTX-M-14+ bla-TEM型對頭孢他啶具有更高的耐藥率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，天水地區(qū)尿路感染患者產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌以bla-CTX-M-14和bla-TEM基因型占絕對優(yōu)勢，攜帶模式以單一模式為主，復(fù)合模式較少見，未見其它模式；產(chǎn)ESBLs菌株呈現(xiàn)多重耐性，但對碳青霉烯類、磷霉素和呋喃妥因呈現(xiàn)較低的耐藥率，可指導(dǎo)本地區(qū)臨床合理使用抗生素和防控該菌耐藥基因的水平傳播提供參考依據(jù)。