支原體肺炎兒童與健康兒童血清拉曼光譜檢測的差異性研究*

林小平，劉曉良，余 瑤，趙 芳，蘇艷麗

(商洛市中心醫(yī)院檢驗科，陜西商洛 726000)

近年來，肺炎支原體肺炎(mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)在兒童中的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，尤其是3～7歲的兒童，發(fā)病率約為44%，并且患兒的年齡趨于低齡化[1-2]，而肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae，MP)是兒童發(fā)生MPP的主要原因[3]。目前對MP的實驗室診斷方法主要有病原體分離培養(yǎng)技術(shù)和核酸檢測技術(shù)、血清學(xué)診斷技術(shù)等方法，但是這些檢測方法目前都存在一定的局限性[4]。基于現(xiàn)有的MP診斷狀況，發(fā)展一種高靈敏度和便捷的檢測手段，對于該病的早期診斷具有非常實用的醫(yī)學(xué)價值。

拉曼光譜技術(shù)分析速度快、所需樣品濃度低、無需預(yù)處理樣品、不破壞樣品、靈敏度較高，現(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)諸多研究領(lǐng)域中的有力武器[5]。本研究檢測MPP患兒和健康兒童的血清拉曼光譜信號，研究其差異性，初步探索將拉曼光譜檢測技術(shù)應(yīng)用到兒童MPP診斷的可行性。

1材料與方法

1.1 研究對象 選取商洛市中心醫(yī)院2017年4～12月收治的MPP患兒血清100例作為實驗組，年齡在8個月～14周歲。另選取同期正常兒童血清100例作為對照組，所有樣本均在早晨空腹抽血分離血清待測。

1.2 儀器 采用HORIBA公司的XploRA PLUS全自動顯微拉曼系統(tǒng)。

1.3 方法 根據(jù)本課題組優(yōu)化好的血清樣本測試方法，選取血清2.5 μl，點至載玻片上，靜置孵育30 min；使用全自動顯微拉曼系統(tǒng)檢測。測試條件如下：激光波長532 nm，光柵1 800 g/mm，激光功率100%，采集時間25 s，采集次數(shù)1次，光譜范圍400 cm-1～1 800 cm-1。為了減少電噪音、宇宙射線以及光功率波動等不利因素的影響，每個樣本測量3次，取平均值，所得光譜進行歸一化處理后用于分析。

2結(jié)果

2.1 兩組血清的拉曼圖譜 見圖1。在位移490.47，1 152.93，1 515.33，1 653.34cm-1處兩組血清的拉曼光譜峰強弱存在差異性。

圖1 兩組血清的拉曼圖譜(a：健康；b：MPP；c：差異譜)

2.2 拉曼光譜峰強度比較 見圖2。與對照組相比，在位移1 152.93與1 515.33cm-1處實驗組血清拉曼光譜峰得到了增強，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.027，2.028，均P<0.05)，在位移490.47與1 653.34 cm-1處實驗組血清拉曼光譜峰發(fā)生了減弱，其中在位移490.47 cm-1處兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.260，P>0.05)，在位移1 653.34 cm-1處兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.137，P<0.05)。

2.3 拉曼譜峰歸屬 查閱資料，分析后發(fā)現(xiàn)血清各拉曼光譜峰大部分歸屬于酪氨酸、苯丙氨酸、β-胡蘿卜素、酰胺Ⅰ、α螺旋、磷脂、N-乙酰基葡萄糖、D-葡萄糖和葡萄糖醛酸等物質(zhì)。其中在位移1 152.93，1 515.33 cm-1處拉曼峰主要歸屬于β-胡蘿卜素；在位移1 653.34 cm-1處拉曼峰歸屬于酰胺Ⅰ、α螺旋和磷脂，見表1。

表1 拉曼光譜峰歸屬(單位：cm-1)[6-8]

*P<0.05

3討論肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae，MP)是一種原核病原微生物，其大小介于病毒和細(xì)菌之間。它是兒童呼吸道感染的重要病原體之一，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，發(fā)病率逐年上升[9-10]。目前對于MP的檢測，無論是病原體分離培養(yǎng)技術(shù)、核酸檢測技術(shù)，還是血清學(xué)診斷技術(shù)，都存在著一些缺陷[4]：如病原體分離培養(yǎng)技術(shù)是診斷MP感染的有效方法，能夠直接檢測到MP，但是此法檢出率低、培養(yǎng)條件嚴(yán)苛、耗時較長、操作復(fù)雜， 且在MP感染早期不敏感， 因而臨床使用上常受到限制；核酸檢測技術(shù)雖然敏感性高，但是容易受到污染，假陽性率較高，操作方法復(fù)雜，使得目前臨床使用受限，大多醫(yī)院并未廣泛應(yīng)用；血清學(xué)診斷技術(shù)主要是檢測患兒血清中的MP抗體，但陽性結(jié)果也不能確診感染了MP，需要與臨床癥狀結(jié)合來進行分析，而部分患者感染MP后不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生的抗體量特別少，不能被檢測出來[11-12]。現(xiàn)有的檢測方法的不完善使得MPP的診斷時間延后，影響患者的治療，因此發(fā)展一種靈敏度高、檢測時間短、操作簡便的MP檢測方法具有重要意義。

拉曼效應(yīng)普遍存在于一切分子中，無論是氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)，而且每一種物質(zhì)的拉曼光譜都只與其自身的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，與入射光頻率無關(guān)。近年來，拉曼光譜技術(shù)在物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和物質(zhì)定性、定量分析等方面的應(yīng)用得到了快速發(fā)展。血清拉曼圖譜已經(jīng)可以作為一種指紋圖譜，來反映不同機體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物分子的差異性，用來推斷機體生理變化，進而進行相關(guān)疾病的診斷[5]。本課題對MPP患兒和健康兒童的血清研究表明，小兒感染MP后，血清拉曼光譜峰的強弱發(fā)生了改變。查閱資料，分析相關(guān)拉曼光譜峰的歸屬，發(fā)現(xiàn)造成這種改變的原因可能是MPP患兒血清中β-胡蘿卜素水平的升高和酰胺Ⅰ與磷脂水平的降低。據(jù)此，可以說明MPP患兒與健康兒童血清拉曼光譜信號存在差異性，這就為血清拉曼光譜檢測技術(shù)應(yīng)用于兒童MP檢測奠定了相關(guān)理論基礎(chǔ)。但本實驗檢測的標(biāo)本量有待擴大，條件需要進一步優(yōu)化，而且需要研究血清中β-胡蘿卜素、酰胺Ⅰ和磷脂水平與MP的相關(guān)性，從而為兒童MP的快速檢測提供便利。