日本積水公司血漿全程C-反應(yīng)蛋白膠乳免疫比濁法最低檢測限和功能靈敏度的確認*

謝正媛，陳涓涓，祖維磊，李奕曉，李 欣，孫 虹

(云南省人口和計劃生育科學技術(shù)研究所西部孕前優(yōu)生重點實驗室 云南省生育調(diào)節(jié)與少數(shù)民族優(yōu)生重點實驗室，昆明 650021)

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種由肝臟合成的蛋白質(zhì)，因能與肺炎球菌細胞壁C多糖結(jié)合而得名，是目前最有價值的急性時相反應(yīng)蛋白，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病[1]、各類心血管疾病的診斷及監(jiān)測[2-3]。使用檢測低限≤0.3 mg/L方法檢測到的CRP即為超敏C-反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)，其水平與動脈粥樣硬化及急性腦梗死(ACI) 的發(fā)生、嚴重程度及預(yù)后密切相關(guān)[4]。有文獻報道我國健康人群hs-CRP的中位數(shù)為0.58～1.13 mg/L，hs-CRP濃度≥3.0 mg/L可作為心血管疾病風險發(fā)生的潛在標志物[5]。鑒于hs-CRP在心血管疾病風險評估中的重要價值，實驗室進行hs-CRP檢測時需評估檢測低限是否滿足hs-CRP的要求，本研究參照相關(guān)文獻[6-7]對日本積水醫(yī)療株式會社全程CRP試劑最低檢測限(lowlimit of detection，LLD)和功能靈敏度(funtional sensitivity，F(xiàn)S)進行了確認，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果進行報道。

1材料與方法

1.1 實驗樣本

1.1.1 空白樣本：根據(jù)試劑盒要求用生理鹽水為空白樣本。

1.1.2 低濃度系列檢測樣本：因試劑盒提供的最低檢測限為0.1 mg/L，以生理鹽水為稀釋液，將廠家提供的3.0 mg/L濃度標準液稀釋成理論濃度為0.10，0.30，0.60，1.20，2.40和3.00 mg/L的低濃度系列樣本備用。

1.2 試劑和儀器 日本積水醫(yī)療株式會社全程CRP檢測試劑盒，CRM470校準品(國際有證參考材料)，6點校準品(3.0，6.0，30.0，180.0，300.0，420.0 mg/L)，美國雅培公司CI-16200全自動生化分析免疫一體機。

1.3 方法 膠乳免疫比濁法。

1.3.1 取空白樣本1份批內(nèi)重復(fù)測定10次，記錄每次測定結(jié)果的吸光度A(儀器定期進行校準，檢測前做室內(nèi)質(zhì)控在控)。

1.3.2 標準曲線：取空白樣本和6個濃度校準品進行雙份測定，記錄每次測定結(jié)果的吸光度A均值。

1.3.3 取低濃度系列樣本每天測定1次，連續(xù)測定10天，記錄每天測定結(jié)果的吸光度A。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010統(tǒng)計軟件進行。

1.4.2 繪制低濃度系列標準曲線：將S0～S6系列樣本的吸光度A與相應(yīng)的理論濃度制成低濃度系列標準曲線備用。

1.4.3 繪制低濃度系列樣本CV%與理論濃度的曲線圖：以低濃度系列樣本的CV%為Y軸、理論濃度為X軸制圖。在圖上找到CV%最接近20%的點，該點對應(yīng)的分析物濃度即為CRP試劑的功能靈敏度[6-7]。

表1 空白樣本和系列低濃度樣本CRP檢測結(jié)果的吸光度A

2結(jié)果

2.1 空白樣本與6個低濃度系列樣本10次檢測結(jié)果的吸光度A見表1。由表1可見隨著樣本濃度的升高，檢測結(jié)果吸光度的CV%逐漸下降。

2.2 全程CRP試劑盒的LLD 99.7%可能性估計的LLD=A空白+3s空白=0.000 9+3×0.000 3=0.001 8A，既檢測低限的吸光度為0.001 8A，為檢測系統(tǒng)的噪聲。由表1可見0.001 8A相當于樣本S1和S2(0.1～0.3 mg/L)之間所產(chǎn)生的吸光度，在系列低濃度的標準曲線上查閱吸光度值0.001 8A對應(yīng)的CRP理論濃度為0.21 mg/L，既全程CRP檢測方法在本實驗室的最低檢測限為0.21 mg/L。

2.3 全程CRP試劑盒的功能靈敏度 查CRP理論濃度與吸光度CV%關(guān)系圖(圖1)可見，CV%為20%對應(yīng)的CRP理論濃度是0.27 mg/L，既全程CRP檢測方法在本實驗室的FS為0.27 mg/L。

圖1 CRP理論濃度與吸光度CV%關(guān)系圖

3討論最低檢測限指能檢測到的樣本中分析物最小量，是基于零濃度基礎(chǔ)上檢測方法對空白樣本測定的噪音，用于區(qū)分從無到有的分析能力，臨床多用于測定人體內(nèi)不存在的分析物。功能靈敏度指在實際檢測中能夠測到的待測物最低濃度值，以天間重復(fù)CV%為20%對應(yīng)的檢測限樣本平均濃度代表某個定量檢測可報告低限。這個值一般要比最低檢測限高，用于區(qū)分從有到無的分析能力，臨床上用于測定人體內(nèi)存在的極微量分析物。hs-CRP的定量檢測限是可以為臨床提供可靠定量數(shù)據(jù)的重要限值，但本實驗室使用的檢測方法僅提供線性范圍0.1～420 mg/L，未提供檢測低限，經(jīng)確認最低檢測限和功能靈敏度都能滿足檢測低限≤0.3 mg/L的要求。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，實驗室將會更多的采用高敏或超敏方法來檢測具有較高臨床價值的低含量物質(zhì)，除hs-CRP外目前常用的還有高敏心肌肌鈣蛋白和B型利鈉肽原等，其相關(guān)的國際或國內(nèi)指南如心力衰竭標志物指南[8]和高敏心肌肌鈣蛋白在急性冠脈綜合征中的應(yīng)用中國專家共識[9]都對其測定方法的不精密度和檢測低限提出要求。實驗室在使用這些方法時，應(yīng)按照行業(yè)相關(guān)要求對其檢測低限和功能靈敏度進行確認，以明確其性能是否滿足要求，才能讓檢驗結(jié)果更好地服務(wù)于臨床。