新生兒ABO溶血病微柱凝集法放散試驗中放散液劑量優化研究*

屈柯暄，周麗華，王淑霞，呂孟興

(1.昆明市兒童醫院輸血科，昆明 650228；2.昆明市婦幼保健院檢驗科，昆明 650031)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborns，HDN)主要是指母嬰血型不合引起的新生兒同種免疫性溶血性疾病，在我國以母嬰ABO血型不合導致的ABO溶血病(ABO-HDN)最多見。該病的診斷主要依靠血型血清學檢查，放散試驗陽性是確診新生兒溶血病最重要的依據[1-2]。由于新生兒血液的特點(血型抗原表達數量少及發育不完全，血漿抗體效價低等)，在日常工作中放散試驗往往出現較弱的陽性結果，與患兒臨床癥狀不相符；部分患者臨床癥狀符合新生兒溶血病，或按照新生兒溶血病治療效果好，放散試驗結果卻為陰性，給臨床早期診治帶來極大困擾。為提高放散試驗的陽性檢出率，為臨床早診斷早治療提供實驗室依據，降低ABO-HDN對新生兒造成的損害，我們采用目前敏感度高、特異度強的微柱凝集法 (microcolumn gel test，MGT) 對臨床診斷為ABO-HDN的新生兒血液標本進行檢測，根據微柱凝集卡反應腔容量，每個血標本同時選擇三種不同劑量的放散液進行平行試驗，現將結果報道如下：

1材料與方法

1.1 研究對象 2018年1～9月，以黃疸或高膽紅素血癥收入三級甲等兒童醫院的新生兒患者869例，排除母親和新生兒血型相同的病例257例；排除不規則抗體引起的新生兒HDN患者5例；排除其它原因(感染、窒息、母乳性黃疸等)引起的高膽紅素血癥的患兒166例，最終選取母嬰ABO血型不合、出生后24 h內出現黃疸或高膽紅素血癥并迅速發展，按照ABO-HDN治療效果好的新生兒441例，采集患兒EDTA抗凝血標本3 ml備用。新生兒高膽紅素血癥診斷參考文獻[3]；HDN診斷標準參考文獻[4]。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑耗材：ABO血型反定型試劑盒(人血紅細胞)、不規則抗體檢測試劑(人血紅細胞)、低離子強度鹽溶液、ABO，RhD血型定型檢測卡(單克隆抗體)、ABO，RhD血型檢測卡(微柱凝集)、抗人球蛋白檢測卡(不規則抗體篩檢)，以上試劑均由長春博迅生物技術有限責任公司提供；昆明南疆制藥0.9 g/dl氯化鈉注射液；泰州科健醫療用品有限公司12*100mm玻璃試管；泰州為爾康醫療用品有限公司2 ml一次性塑料吸管。

1.2.2 儀器設備：長春博研科學儀器有限公司TD-3A型血型血清學用離心機、FYQ型免疫微柱孵育器；安徽中科中佳科學儀器有限公司LC-10C低速離心機；日本Kubota公司KA-2200血型血清學專用離心機；上海躍進醫療器械有限公司HH-W21-600S型電熱恒溫水浴箱；Eppendorf移液器。

1.3 方法 納入研究的441例新生兒血液標本，均采用微柱凝集法進行放散試驗，試驗操作參照《輸血技術操作規程(輸血科部分)》[5]及試劑盒說明書。根據微柱凝膠卡反應腔容量(約200 μl)，每個血標本均同時選擇低(25 μl)，中(50 μl)，高(100 μl)三種劑量的放散液進行平行試驗，操作步驟：①取微柱凝膠抗人球蛋白檢測卡一張 ，做好25，50，100 μl標記。用低離子強度鹽溶液將ABO血型反定型試劑盒(人血紅細胞)配成0.8 ml/dl～1 ml/dl濃度，分別加入微管中，各50 μl。②按標記劑量逐一加入制備好的放散液，最后一管加入末次洗滌液50 μl。③置37℃免疫微柱孵育器，孵育15 min。TD-A型血型血清學專用離心機離心5 min，取出，觀察結果。④凝集強度判定同檢測卡操作說明書結果解釋部分，見圖1。⑤放散試驗結果判讀[6]參照表1。

表1 放散試驗結果判讀

注：“+”代表陽性，包括凝集強度為±，1+，2+，3+，4+的凝集；“-”代表陰性。

圖1 凝集結果判定與ABO血型反定型

將試驗結果按照三種劑量分為25 μl組，50 μl組和100 μl組。計算三組實驗結果的陽性百分率。

1.4 統計學分析 采用SPSS17.0軟件對數據進行處理，收集的三種劑量試驗結果屬于計數資料，用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，當P<0.05表示陽性檢出率差異有統計學意義，當P<0.001表示陽性檢出率差異有統計學顯著性意義，比較三種劑量放散液陽性檢出率，得到最佳放散液劑量。

2結果

2.1 2018年1～9月納入研究的新生兒基本情況統計 見表2。

表2 研究對象基本情況

2.2 不同劑量放散液陽性檢出率的比較 見表3。在臨床診斷為ABO-HDN的441例新生兒血液標本中，三種劑量放散液陽性檢出率為82.09%，82.77%和99.55%。25 μl和50 μl兩組陽性檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)；25 μl和100 μl兩組陽性檢出率比較差異有統計學顯著性意義(P<0.001)；50 μl和100 μl兩組陽性檢出率比較差異有統計學顯著性意義(P<0.001)。

表3 不同劑量放散液陽性檢出率比較

注：a代表25 μl組和50 μl組比較；b代表50 μl組和100 μl組比較；c代表25 μl組和100 μl組比較。

3討論ABO-HDN是兒科最常見的急性溶血性疾病，引起的高膽紅素血癥一般在出生后24 h內出現并迅速發展，引起膽紅素腦病或繼發性核黃疸，對新生兒造成永久性神經系統發育損傷，由此可見ABO-HDN引起的潛在危險性不容忽視[1，7-8]。但是由于新生兒血液特點(血型抗原表達數量少及發育不完全，血漿抗體效價低等)，同時溶血性抗體隨疾病進展而逐漸消耗等原因，可能造成確診疾病的放散試驗出現假陰性結果，給臨床早期診斷帶來困擾。

本研究收集三級甲等兒童醫院近10個月的黃疸或高膽紅素血癥新生兒病例資料869例，通過排除法，最終得到符合研究條件的新生兒441例。在統計病例資料時，我們發現有64.6%的新生兒在1～6天的日齡范圍內出現明顯的黃疸或高膽紅素血癥等臨床癥狀；有75.7%的新生兒靜脈血膽紅素值在201～400 μmol/L的較高水平，說明ABO-HDN疾病進展快，膽紅素水平高，容易引起膽紅素腦病或繼發性核黃疸，嚴重危害新生兒健康。因此，對ABO-HDN放散試驗進行優化研究有重要臨床意義。

有文獻報道，增加放散液的劑量，可以提高放散試驗的陽性檢出率，放散液增加到75 μl時，陽性檢出率提高到73.19%[9]。國內外文獻報道微柱凝集法進行新生兒溶血病血清學檢測試驗，敏感度高，特異度強，有助于提高新生兒溶血病的陽性檢出率[10-12]。為了提高ABO-HDN放散試驗的陽性檢出率，我們選擇美國血庫協會[13]、英國血液標準化委員會推薦的，有助于提高新生兒溶血病陽性檢出率的微柱凝膠抗入球蛋白法(MGT)方法進行放散試驗的優化研究。根據微柱凝集卡反應腔的容量(約200 μl)，設計低、中、高三種劑量放散液進行平行試驗，結果顯示：在臨床診斷為ABO-HDN的441例患兒中，25 μl放散液組有79例結果表現為假陰性、未被檢出；50 μl放散液組有76例結果表現為假陰性、未被檢出；而100 μl放散液組只有2例結果表現為假陰性、未被檢出。將3個劑量組陽性檢出率進行統計分析，我們發現100 μl組陽性檢出率明顯高于其它劑量組，檢驗效果最佳。其次，在研究中我們發現增大放散液劑量能有效增強凝集強度。當25 μl和50 μl放散液組試驗結果陽性時，凝集強度較弱，多為±，1+，2+；使用100 μl劑量放散液時，凝集強度較強，多為3+至4+。100 μl組放散液檢測結果為較弱的1+或±時，25 μl和50 μl組檢測結果就會出現假陰性等漏檢的情況。我們分析多是因為新生兒血型抗原表達數量少及發育不完全，其結合的IgG類血型抗體少，經過熱放散后放散液中IgG抗體效價低導致。

綜上所述，在ABO-HDN微柱凝集法放散試驗中，選取100 μl劑量放散液，試驗效果好、陽性檢出率高、凝集強度大，能有效提升放散試驗臨床診斷價值，為早期ABO-HDN診斷提供有力的實驗室依據，減輕溶血病對新生兒造成的嚴重危害。同時，為新生兒溶血病血清學檢測標準操作程序的制定提供參考依據。