熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度的評定與應用探討*

李育敏，徐 怡，闞麗娟，張水蘭，湯花梅，許曉清，熊 丹，張秀明

(深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001)

測量不確定度(簡稱不確定度)，是指表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數[1]。熒光定量PCR檢測HBV DNA的不確定度評定、報告及應用是近年來醫學實驗室關注的問題。首先，評定不確定度是改進醫學實驗室質量的有效途徑。而目前國際上發布的《測量不確定度評定指南》(guide to the expression of uncertainty in measurement，GUM)[2]和《測量不確定度的量化》(quantifying uncertainty in analytical measurement，QUAM)[3]等文件如直接用于臨床基因擴增檢驗尚缺乏實用性。其次，ISO/IEC 17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》[4]，ISO 15189《醫學實驗室質量和能力的專用要求》[5]、美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)C51-P指南[6]以及中國合格評定國家認可委員會(CNAS)最新發布的CNAS-CL01-G003《測量不確定度的要求》[7]除了對不確定度評定提出要求外，還強調實驗室應該提供檢測結果的不確定度，在適用時檢測報告中應報告結果的不確定度。第三，熒光定量PCR靈敏度高，同一實驗室以及不同實驗室間結果可比性保證存在一定局限性，建立量值溯源性可使檢測結果達到一致性。第四，國內學者[8-10]先后對熒光定量PCR測定HBV DNA的不確定度進行了評定以及介紹不確定度報告及應用，但在評定方法及臨床應用上仍需進一步探討。本研究參考文獻[8-10]及CNAS技術報告CNAS-TRL-001《醫學實驗室-測量不確定度的評定與表達》[11]對本實驗室熒光定量PCR測定HBV DNA的不確定度進行評定，并對不同評定方法進行比較，以及對不確定度報告的臨床應用進行探討。

1材料與方法

1.1 材料 批內重復性實驗取2例HBV DNA濃度分別在103IU/ml和106IU/ml水平的患者血清(其不確定度評估濃度參照高、低2個室內質控物水平選擇)。批間重復性實驗采用室內質控物(北京康徹思坦)，高水平為4.60E+06 IU/ml(批號201609003)，低水平為1.41E+03 IU/ml(批號201607003)，按照廠家說明書分裝保存于-15℃以下。

1.2 試劑與儀器 試劑為湖南圣湘生物科技有限公司的HBV DNA熒光定量PCR試劑盒，線性范圍為1.0E+02～5.0E+09 IU/ml。儀器為羅氏cobas○Rz480熒光定量PCR分析儀。操作按照試劑盒和儀器說明書進行。

1.3 測量不確定度的評定

1.3.4 擴展不確定度(U)的評定[8-9]：U=Uc×k，k為包含因子，對于正態分布，取P=95%置信區間，k=1.96。

1.4 測量不確定度報告 以測量觀測值n=2為例，報告為：HBV DNA測定結果：X±UIU/ml(k=1.96，n=2)，X為測量結果的對數值。適用檢測范圍為1.0E+02～5.0E+09 IU/ml。測量量值與臨床決定限進行診斷性比較時，取k=1.96，兩者差值△符合|△|≥1.96Uc或|△|≥U，差異具有統計學意義。

2結果

2.1 各分量結果 熒光定量PCR測定HBV DNA不確定度各分量數據見表1。批內和批間重復性引入的不確定度分量隨測量觀測值數量的增加而減小；批內重復性引入的不確定度[U(w)]所占比重最低。采用EQA同方法組均值評定偏移引入的不確定度[U(bias)]，以偏移與偏移的標準差評定U1(bias)較以方法和實驗室偏移評定U2(bias)低。

表1 熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度的各分量數據

注：U(w)，批內重復性不確定度；U(b)，批間重復性不確定度；U1(bias)，以偏移與偏移的標準差評定偏移不確定度；U2(bias)，以方法和實驗室偏移評定偏移不確定度；n，測量觀測值個數；靶值，表示用EQA靶值評定U(bias)；同方法組均值，表示用EQA同方法組均值評定U(bias)。

2.2Uc和U隨測量觀測值數量的增加而減小 見表2、表3。

表2 采用EQA靶值評定熒光定量PCR測定HBV DNA的Uc和U(k=l.96)

在檢測范圍內，同一測量觀測值條件下，低濃度水平處的Uc和U較高濃度高。采用EQA靶值評定U(bias)，取n=1，在低濃度水平處以偏移與偏移的標準差評定的偏移不確定度[U1(bias)]計算Uc1和Uc2分別為0.215 2和0.197 0，與以方法和實驗室偏移評定的[U2(bias)]計算Uc1和Uc2(0.215 1和0.196 9)相近；同樣采用同方法組均值評定U(bias)，以U1(bias)評定Uc和U與以U2(bias)評定結果相近。同一U(bias)條件下，采用EQA靶值和同方法組均值評定Uc和U結果相近。

表3 采用EQA同方法組均值評定熒光定量PCR測定HBV DNA的Uc和U(k=l.96)

2.3 測量不確定度報告 取k=1.96，n=2，如樣本的檢測結果為1.0E+02 IU/ml(2.0 IU/ml，LOG值)，其測量量值為2.0±0.330 2 IU/ml，即1.67～2.33 IU/ml，與臨床決定限(檢測下限2.0 IU/ml，LOG值)進行比較，檢測結果達到臨床決定限，但其測量量值減去擴展不確定度后低于臨床決定限，因此無法確定其結果是否為臨床決定限水平。如樣本的測量量值為3.0E+02 IU/ml(2.48 IU/ml，LOG值)，取k=1.96，則測量量值為2.15～2.81 IU/ml，高于臨床決定限水平。

2.4 兩個測量量值比較 取k=1.96，n=2，如患者治療前后的兩次量值均在本實驗室測量，取U為0.330 2，則兩次測量量值差值△≥0.46(1.4×0.330 2)IU/ml，差異具有統計學意義。

3討論國內外學者均提出自上而下評定常規醫學實驗室不確定度是可接受和實用的方法[6，11-12，14-17]。本研究利用該方法評定HBV DNA測定的不確定度，首先進行A類評定，即采用批內和批間重復性評定不精密度/實驗室內復現性分量引入的不確定度，其U(w)和U(b)均較已報道低[8-9]，表明本實驗室的不精密度小，與其他實驗室相比性能數據可接受。多數學者[16，18]認為生化檢驗只需評定批間精密度，因為常規標本一般不進行重復測量，批內精密度不能反映實際檢測情況，因此只采用IQC數據來評定批間不精密度的不確定度。本研究也表明批內重復性引入的U(w)所占比重最低，通過批內加批間重復性和偏移評定HBV DNA的不確定度與批間重復性加偏移評定結果相近。

應用EQA數據評定正確度/偏移引入的不確定度是醫學實驗室常用的方法。本研究通過B類評定，表明U(bias)在不確定度中所占比重較U(b)低，與蔣玲麗[9]等報道相符合，而沈偉鋒等[8]在早期報道中U(bias)較高，可能與近年來參加EQA HBV DNA項目的實驗室數量增多以及測定水平提高導致U(bias)較小有關。目前文獻[8-9]報道HBV DNA測定的偏移不確定度評定是參考王治國等[12]以偏移和偏移的標準差評定U(bias)，而生化檢驗的不確定度評定多采用Nordest[13]以方法和實驗室偏移評定U(bias)。本研究數據表明利用EQA靶值，以上兩種方法評定的U(bias)無明顯差異；利用同方法組均值，U(bias)有一定差異，但取n=1，Uc1和Uc2與EQA靶值評定的結果接近，說明以上兩種方法均可用于評定HBV DNA測定的偏移不確定度。蔣玲麗等[9]采用衛健委臨檢中心和CAP的EQA數據進行偏移不確定度評定時，兩者差異較大，分析原因為衛健委臨檢中心采用溯源至國家標準品得出的檢測值作為靶值，而CAP以方法組均值作為靶值，因此提出采用EQA數據評定不能反映實驗室的真實不確定度。沈偉鋒等[10]采用國家標準物質評定不同實驗室的HBV DNA測量不確定度，提出其評定的不確定度報告使檢測結果具有可比性。由于EQA樣本經過加工，與臨床樣本存在差異，結合本研究數據和文獻[8-10]，建議測定國家標準物質來評定HBV DNA測量不確定度，如采用EQA數據，以同方法組均值計算U(bias)。

目前臨床治療乙肝以乙肝表面抗原定量結果和HBV DNA定量結果作為評價患者體內病毒復制水平和臨床抗病毒療效判斷的金標準，但是通常根據經驗認為HBV DNA水平降低或升高1～2個數量級為有意義。有學者[8，10]提出將不確定度隨測定結果報告給臨床可使結果比較科學量化，避免以往的盲目判斷標準。本研究表明如患者治療前后的兩次結果均在本實驗室測量，差值≥0.46，具有統計學意義，為臨床進行治療前后的結果比較提供了依據，有助于判斷患者體內病毒復制水平和抗病毒療效。

綜上所述，本研究對CNAS及文獻的不確定度不同評定方法進行了比較，并提出本實驗室評定的HBV DNA不確定度報告在患者治療前后療效判斷的臨床意義，為熒光定量PCR測定HBV DNA不確定度的評定和應用提供了一定的參考依據，但是采用EQA數據還是國家標準物質測定數據對評定和應用更具有價值還有待更多的研究。臨床實驗室是近年來才開始引入測量不確定度的概念，業內一直存在關于評定不確定度和總誤差的爭論[19-20]，未來不確定度能否取代總誤差也需進一步探討。