子體鉛誘導T30695構象改變N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)熒光探針檢測氡

劉紅文,劉士蒙,李詩雅,楊桂英,劉 然,呂昌銀

(南華大學 公共衛生學院，湖南 衡陽 421000)

氡是238U、235U和232Th等放射性核素的衰變產物，無色無味，易溶于水，半衰期為3.82天，其衰變產生的子體210Pb的半衰期長達21年[1-3]。氡是室內放射性氣體污染物的主要存在形式，人類所遭受的自然輻射劑量中有一半來自氡的輻射。氡及其衰變子體形成的氣溶膠被人體吸入后，可蓄積在人體肺細胞組織和骨骼中，衰變過程產生的α粒子將會破壞細胞核中的 DNA分子，造成人體呼吸系統、血液系統疾病和細胞遺傳學損傷[4-5]。氡及其子體已經成為引發肺癌、白血病、皮膚病以及其他呼吸道疾病的重要元兇[6]。現代人約有80%的時間在室內度過，氡污染引起的人體健康問題受到越來越多的關注。因此監測環境中氡的濃度對保障人類健康具有重要意義。

傳統的放射性氣體氡的檢測方法，多是基于核科學和物理學領域中針對氡輻射產生的α射線等來測定氡累積濃度的物理檢測方法。近年來，核酸適配體因其高效特異的結合能力，無毒性、易合成、穩定性好等優點，已成為重金屬檢測領域的研究熱點[7]。Wang等[8]篩選出可與Cd2+作用并產生二級結構構象變化的核酸適配體，并基于此構建了一種可檢測低濃度Cd2+的生物傳感器。Zhu等[9]設計了一種銀特異性的核酸適配體，可與低濃度的Ag+形成G-四鏈體結構，并產生熒光猝滅作用，實現對低濃度Ag+的定量檢測。Chen等[10]經過18次的陽性和陰性選擇，獲得了兩種具有高度結合性和特異性的核酸適配體，并據此設計了熒光生物傳感器用于Pb2+檢測。

1998年Arthanari等報道了一種不對稱的陰離子活性卟啉熒光染料—N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM)，其最大吸收波長約為399 nm，最強發射峰波長在610 nm左右。NMM自身的熒光強度很弱，很難與單鏈DNA、雙螺旋結構的DNA結合，但可與G-四鏈體結構產生特異性結合，結合后體系熒光強度明顯增強[11]。作為G-四鏈體的熒光染料，NMM已經在生物分析技術領域得到了廣泛地應用。本文根據氡輻射衰變的特點，結合鉛離子的現代分析新技術，以NMM作為熒光探針，探討了Pb2+誘導富G序列形成G-四鏈體的特性，建立了一種基于Pb2+誘導富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈T30695構象改變的熒光傳感器對鉛和氡進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；J-815圓二色譜光譜儀(日本Jasco公司)；RAD7 Electronic radon detector(美國Durridgce公司)；氡室(南華大學核工業第六研究所)；混合纖維素膜(Merck Milipore公司)。

冰醋酸(HAc，天津市福晨化學試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鉛標準溶液(100.0 μg/mL，中國計量科學院)；富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)與互補鏈C-T30695(5’-ACCCACCCACCCACCC-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)；熒光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM,百靈威公司)；實驗用水為滅菌超純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)。

1.2 氡樣本的采樣方法

以10 mL 0.2%(體積分數)醋酸為吸收液，以直徑70 mm，高17 mm的一次性塑料培養皿為收集器，在平皿口加封混合纖維素膜(孔徑為0.8 μm)；設定采樣時間，將采樣器放入氡室，被動式采集含鉛樣本。采樣后密封,室溫放置4 d，用0.2%的醋酸定容至10 mL，混勻，4 ℃冰箱保存，待測[12-14]。

1.3 Pb2+標準溶液的紫外光譜測定

將T30695及C-T30695分別配制成1 μmol/L的工作溶液，于95 ℃的金屬恒溫儀中加熱5 min，置于空氣中迅速冷卻至室溫，備用。在反應管中，依次加入100 mmol/L Tris-HAC緩沖溶液(pH 7.25)50 μL，1 μmol/L T30695溶液20 μL，以及一定量的鉛標準溶液，混勻，于室溫孵育80 min。

加入1 μmol/L的C-T30695溶液20 μL，于室溫下孵育15 min后，加入NMM染料(1.72×10-5mol/L) 50 μL，加超純水至200 μL，混勻，室溫下避光孵育10 min后待測。設置儀器的激發波長為399 nm，發射波長為610 nm，測定各管的熒光強度值(IF)，以超純水作空白測定熒光值(IF0)，計算ΔIF=IF0-IF，建立熒光強度差(ΔIF)對鉛離子濃度(c)的線性回歸方程。

2 結果與討論

2.1 熒光傳感原理

氡衰變形成穩定的子體鉛只需約3.82 d，且衰變產生的子體鉛210Pb非常穩定。本實驗以子體鉛作為目標檢測物，建立了氡的免標記熒光DNA傳感器生物分析新方法。用含0.2%醋酸吸收液的采樣皿進行被動式采樣，氡進入采樣皿后，衰變產生子體鉛，隨后在稀醋酸中轉變形成鉛離子。

實驗原理如圖1所示。NMM單獨存在時熒光很弱，在沒有Pb2+存在的條件下，富鳥嘌呤DNA單鏈T30695與互補鏈C-T30695結合形成雙鏈結構，不能與NMM結合，NMM游離在溶液中，體系產生弱熒光；當體系中導入Pb2+時，Pb2+誘導富G單鏈T30695發生構型轉變，形成G-四鏈體結構，熒光染料NMM嵌入G-四鏈體結構中，產生強的熒光。在一定濃度范圍內，兩體系熒光信號差值ΔIF與Pb2+濃度呈線性關系。據此，建立了基于鉛誘導T30695構象改變的熒光法檢測鉛和氡。

圖1 基于Pb2+誘導特異性核酸適配體構象轉變的非標記熒光法測氡原理圖Fig.1 Schematic diagram of radon label-free fluorescent detection based on structure exchange of aptamer

2.2 實驗機制可行性分析

文獻[15]報道，NMM與雙鏈DNA的結合能力較低，但能很好地與陽離子誘導形成的穩定G-四鏈體結合，發出較強的熒光。為驗證熒光傳感原理的正確性，進行了機制驗證實驗。結果如圖2所示，當體系中只存在NMM時，設定激發波長為399 nm，測定NMM在560～700 nm處的熒光強度，結果發現體系的熒光強度IF≤400(曲線a)，說明NMM本身的熒光較弱。

圖2 不同實驗體系NMM染料的熒光發射光譜圖Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM in different systems cNMM=4.30 mmol/L,cT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

當向富含鳥嘌呤的DNA單鏈T30695溶液中加入富含胞嘧啶的DNA互補鏈C-T30695后，通過堿基互補配對，T30695與其互補鏈結合成為雙鏈，形成雙螺旋結構。由于NMM不能與DNA雙螺旋結構結合，使得“NMM+T30695+C-T30695”體系測定的熒光強度比較微弱(曲線b)，與“NMM”體系熒光強度相差不大。該實驗結果證明NMM與雙鏈DNA的結合能力弱，產生的熒光也很弱。

當體系中同時存在Pb2+與核酸適配體T30695，進行一段時間孵育后，T30695被Pb2+誘導形成G-四鏈體結構。此時，加入熒光染料NMM可與G-四鏈體結構的核苷酸鏈結合，體系的熒光強度顯著增強，如圖2曲線d所示，“NMM+Pb2++T30695”體系的熒光強度IF≈1 100，且Pb2+離子濃度越大，體系熒光強度增強越多。該實驗結果說明NMM與G-四鏈體結構有較好的結合能力，從而產生較強熒光。

當核酸適配體T30695被Pb2+誘導形成G-四鏈體結構后，再加入互補鏈 C-T30695，二者很難再形成DNA雙螺旋結構。NMM仍可與G-四鏈體結構結合發出較強熒光，如圖2中曲線c所示，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”體系的熒光強度IF≈800，仍然比“NMM+T30695+C-T30695”體系的熒光強度強，且兩者間熒光強度的變化隨著Pb2+離子濃度的增大而增大。該實驗結果說明Pb2+誘導T30695形成了G-四鏈體結構，與NMM結合產生了較強熒光。

圖3 圓二色光譜圖Fig.3 Circular dichroism spectracT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

與“NMM+Pb2++T30695”體系相比，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”體系的熒光強度并沒有達到與之相同的水平。這可能因為體系中存在C-T30695和Pb2+競爭結合T30695，導致仍有少量DNA雙螺旋結構形成，該雙螺旋結構未與NMM結合產生熒光。因此，熒光強度略低于NMM與G-四鏈體結合時的水平[16-17]。

2.3 圓二色譜實驗

為進一步探究熒光強度變化與核酸適配體T30695構象改變間的關系，從分子結構的角度，更好地說明Pb2+誘導T30695發生的構象變化，進行了圓二色譜驗證實驗，結果如圖3所示。核酸適配體T30695單鏈狀態下在265 nm處有一個正峰(曲線a)，加入Pb2+誘導T30695形成G-四鏈體結構后，在265 nm處的正峰顯著升高，并于245 nm處出現了一個負峰(曲線b)，這一結果符合順式平行結構G-四鏈體的特征[18]。單獨將T30695與互補鏈C-T30695孵育一段時間后，在260～285 nm處掃描出正峰，在240 nm左右處掃描出一個明顯的負峰(曲線d)，這一結果符合較典型的多聚鳥嘌呤與胞嘧啶寡核苷酸鏈形成B型雙螺旋結構的圓二色光譜圖特征[16,19]，證明T30695與C-T30695結合形成了B型雙螺旋結構。核酸適配體T30695與Pb2+孵育一段時間后，再加入互補鏈C-T30695，掃描得到一個不是很典型的圓二色光譜圖，245 nm處有一個負峰，265～285 nm處出現了一個較大的正峰(曲線c)，可能是因為這一體系中同時存在G-四鏈體結構和B型雙螺旋結構，因此在245 nm處有負峰，265 nm和285 nm均有正峰[16]。

2.4 實驗條件優化

在pH 6.5～8.0的酸度范圍內對pH值的影響進行了研究。結果顯示，酸度對ΔIF值影響較大。pH 6.75～7.25時，ΔIF值逐漸上升；pH 7.25～8.00時，ΔIF值逐漸下降，所以，實驗選擇pH 7.25的Tris-HAc緩沖液維持體系的酸堿性。同時考察了Tris-HAc用量對檢測性能的影響，隨著Tris-HAc用量的增加，熒光差值ΔIF逐漸增高，在45 μL左右達到平臺，45～70 μL體積范圍內，熒光差值ΔIF趨于穩定。因此，實驗選擇加入50 μL的Tris-HAc緩沖溶液進行后續研究。

對反應體系中Pb2+與T30695的孵育時間進行研究，結果顯示，75 min之前ΔIF值逐漸增大，說明隨著反應時間的增加，形成G-四鏈體的量增加，其與NMM染料結合后，熒光強度(IF)增強，導致熒光差值(ΔIF)也逐漸增加。75 min以后，Pb2+離子已經與之完全結合，ΔIF值的變化趨于平緩。據此，選擇孵育時間為80 min。同時考察了C-T30695孵育時間對實驗體系的影響，根據實驗結果，選擇15 min作為互補鏈C-T30695的孵育時間。

圖4 共存物質對測定體系的影響Fig.4 Responses of the Pb2+ sensors over other competing metal ions concentration：50 nmol/L for Pb2+,5 μmol/L for Bi3+, 2.5 μmol/L for Mn2+,Cr3+,Zn2+

熒光染料NMM的反應時間與濃度對測定結果有一定影響。實驗發現，加入NMM染料前5 min，體系的熒光差值(ΔIF)變化非常大，5 min后，ΔIF的變化趨于平緩，說明此時NMM與G-四鏈體結合已基本完成并發出較強熒光。10 min后體系熒光差值有稍許下降，但變化趨于平緩，可能的原因是，體系中的C-T30695與部分T30695結合，導致熒光差值些許下降，但隨著時間的增長，體系達到穩定狀態，熒光差值變化趨于平緩。因此，實驗選擇10 min作為NMM染料的反應時間。通過考察熒光染料NMM濃度的影響，選擇NMM的反應濃度為4.30×10-6mol/L。

2.5 共存干擾物的影響

圖5 氡累積濃度與熒光強度的關系Fig.5 Correlation curve of fluorescence intensity and radon concentration

2.6 標準曲線與檢出限

按實驗方法操作，測定Pb2+離子標準系列溶液的熒光值IF和未加Pb2+離子的試劑空白溶液的熒光值IF0,計算ΔIF值，繪制標準曲線。 Pb2+濃度在5.13×10-9～1.25×10-7mol/L范圍內與體系的ΔIF值呈現良好的線性關系，回歸方程為ΔIF=77.30+5.05cPb(10-9mol/L)，相關系數r=0.995 0。對空白溶液平行測定11次，計算空白溶液的標準偏差為sb=2.59，按照CL=3sb/k計算得到鉛離子的檢出限為1.54×10-9mol/L。

2.7 氡累積濃度的測定與模型建立

按照采樣方法，在南華大學核六所氡實驗室采集累積濃度分別為0.96、1.95、5.86、11.66、17.42、20.31、23.19(×104Bq·h/m3)的氡輻射樣品溶液，如表1所示，隨著氡累積濃度的增加，鉛含量和樣品的熒光差值ΔIF值(圖5)也逐漸增加。進一步分析圖5發現，在0.96～23.19×104Bq·h/m3的氡濃度范圍內，熒光差值ΔIF與氡累積濃度之間呈對數增長的關系，符合放射性物質指數衰變的特性;但在3.58×104～16.92×104Bq·h/m3氡濃度范圍內，兩者之間存在良好的線性關系：ΔIF=3.60cRn+140.27，r=0.994 9。本方法氡的檢測范圍為3.58×104～16.92×104Bq·h/m3，檢出限為1.07×104Bq·h/m3。對樣品溶液平行測定6次，相對標準偏差(RSD)為1.7%～3.3%，加標回收率為96.0%～104%，表明方法測定干擾小，結果準確可靠，適用于鉛離子和氡積累濃度的檢測。

表1 樣品中Pb2+離子的檢測結果(n=6)Table 1 Determination results of Pb2+ in the samples(n=6)

‘Found’ and ‘Added’ refer to the final concentration

3 結 論

本文以氡輻射的子體鉛為目標檢測物，應用核酸適體構建了一種免標記高靈敏的熒光DNA傳感器，并實現了鉛濃度和氡輻射劑量的生物分析化學測定。方法儀器設備簡單，操作簡單快速，樣品幾乎無干擾，具有較高的靈敏度，對鉛的檢出限為1.54×10-9mol/L，對氡的檢出限1.07×104Bq·h/m3。本法避免了現場進行氡輻射劑量測量的放射性危害，開拓了核酸適配體對無機物、氣體和放射性物質的生物分析新領域。