純水中檢測汞離子與銀離子的菲啰啉類熒光探針

廖 賢，袁劍英，牟 蘭 ，曾 晞

(貴州省大環化學及超分子化學重點實驗室,貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025)

汞及其化合物廣泛應用于化工、照明、醫療器械等領域。汞又是最具毒性的金屬之一，人體內積累的汞可導致認知損傷、運動障礙、失明、胚胎發育異常等，嚴重時將致人死亡[1-2]。人類活動產生的汞易隨空氣及水體遷移擴散，不僅可長時間穩定存在，而且會隨著食物鏈不斷循環累積，因此汞污染對環境有著深遠的影響[3-4]。銀是貴金屬元素之一，含銀化合物被廣泛用于感光膠片洗印、金屬冶煉加工和電鍍等行業[5-7]。然而即使低濃度的銀也對水生生物有著巨大危害，不僅會導致魚類死亡，且當其經由水體進入人體時，還會沉著于各個器官中，進而影響視力、引發癲癇等[8]。因此環境中的痕量汞及銀的檢測對于保護人類健康以及自然環境有重要意義。

目前檢測Hg2+及Ag+的方法有原子吸收光譜法[9-10]、原子發射光譜法[11]等，但存在樣品預處理步驟繁瑣或儀器昂貴等不足。熒光探針因具有靈敏性高、選擇性好、響應時間短、便于實時監測等優點而備受關注[12]。但是目前大多數熒光探針受溶解性限制，不能在純水介質中識別檢測Hg2+及Ag+[13-15]，極大影響了這些探針在實際中的應用。故迫切需要構建一種可以在純水介質中識別Hg2+及Ag+的新型熒光探針。

1,10-菲啰啉是一類含氮雜環化合物，其光電性質出色且易于修飾[16]，是研究最早和應用最廣的含氮雜環化合物之一[17]。菲啰啉類熒光探針被廣泛報道，如Li等[18]通過模擬綠色熒光蛋白設計得到了一種包含菲啰啉基團的化合物，該化合物對Zn2+具有選擇性熒光增強的結合行為，此識別過程可應用于細胞成像；李俊等[15]在菲啰啉上引入兩個水楊醛基團，成功獲得了一類能選擇性識別Cu2+和Ag2+的受體分子;Algi等[19]也基于菲啰啉結構骨架設計合成了在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)與水的混合溶劑中對Zn2+、Cd2+、Ni2+、Cu2+具有識別功能的熒光探針；Alreja等[20]報道了一種菲啰啉衍生物，其對Cu2+表現出良好的選擇性。但已報道的菲啰啉類熒光探針存在水溶性較差及選擇性不佳等問題，本文用1-溴乙酸對中間體a進行修飾，使探針的極性和水溶性得到增強,從而獲得了可在純水介質中檢測Hg2+和Ag+的水溶性探針1，其合成路線見圖1。

圖1 探針1 的合成路線Fig.1 Scheme synthesis of probe 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WNMR-I 500 MHz核磁共振儀(中國科學院武漢物理與數學研究所)；Nano ITC等溫滴定量熱儀(美國TA儀器公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安公司)；Q Exactive 高分辨質譜儀( 美國賽默飛世爾科技公司)；Vertex 70 FT-IR紅外光譜儀(布魯克光譜儀器公司)。

2,9-二甲基-1,10-菲羅啉、吡啶-3-甲醛、酸酐、溴乙酸等購于上海晶純化學試劑公司，金屬高氯酸鹽購于Aldrich and AlfaAesar化學試劑公司。所有藥品均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 探針1的合成

中間體a的合成：在50 mL三口瓶中，加入2,9-二甲基-1,10-菲羅啉(500 mg，2.4 mmol)、吡啶-3-甲醛(520 mg，4.8 mmol)、乙酸酐20 mL，N2保護下回流4 h，反應結束后減壓蒸去溶劑，柱層析(V乙酸乙酯∶V正己烷=2∶8)純化，得350 mg黃色固體a，產率37.7%;1H NMR(500 MHz,CDCl3,ppm)δ:8.90(s,2H),8.58-8.57(d,J=5 Hz,2H),8.29-8.27(d,J=10 Hz,2H),8.05-8.04(d,J=5 Hz,2H),7.96-7.95(d,J=5 Hz,2H),7.84-7.74(m,6H),7.40-7.37(m,2H)。

探針1的合成：在100 mL三口瓶中，加入中間體a(250 mg，0.64 mmol)、溴乙酸(520 mg，3.11 mmol)、乙腈50 mL，N2保護下回流24 h，反應結束后有黑色沉淀析出，過濾得到產物，濾液減壓除去溶劑，用丙酮重結晶，兩次共得390 mg探針1，產率91.7%;1H NMR(500 MHz,D2O,ppm)δ:8.97(s,2H),8.69-8.68(d,J=5 Hz,2H),8.59-8.57(d,J=10 Hz,2H),8.19-8.17(d,J=10 Hz,2H),7.91-7.90(t,J=5 Hz,2H),7.62(s,4H),7.54-7.51(d,J=15 Hz,2H),7.39-7.36(d,J=15 Hz,2H),5.36(s,4H);IR(KBr，cm-1)σ：3 421,2 059,1 634,1 537,1 379,1 158,1 088,968,874,815,710,675,613,521;MS(ESI)m/z:665.077[M+H]+。

1.3 溶液配制

用水溶解探針1，配制成濃度為0.1 mmol/L 的儲備液。金屬離子的高氯酸鹽均用水溶解，配制成濃度為20 mmol/L 的儲備液。

1.4 光譜測量

在10 mL容量瓶中分別加入探針1儲備液(0.1 mmol/L,1.0 mL)和金屬離子儲備液，并用水溶液稀釋至刻度，搖勻，測定熒光光譜。激發波長為350 nm，狹縫為5 nm。

1.5 1H NMR滴定

于一系列核磁管中分別加入500 μL 1 mmol/L的探針1，再分別加入0、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸汞，或0、0.25、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸銀。溶劑為DMSO-D6，25 ℃下測定核磁共振氫譜(500 MHz)。

1.6 等溫量熱滴定

于樣品池內加入探針1溶液(0.1 mmol/L,1.0 mL)，溫度設定為18 ℃，將Hg2+或Ag+的水溶液(2 mmol/L)吸入100 μL的滴定注射器中，設定攪拌速率為250 r/min，連續滴定，一滴體積為4 μL，每滴間隔250 s，共滴25次。參比池內注入水作為樣品池的熱平衡參照，并進行空白實驗以避免稀釋熱的影響。使用該儀器上搭載的Launch Nano Analyze軟件進行數據采集分析。以非線性最小方差擬合，計算相關參數。

圖2 探針1(10 μmol/L，H2O)與不同金屬離子(0.2 mmol/L)作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of probe 1(10 μmol/L,H2O) with different metal ions(0.2 mmol/L)λex/λem=350 nm/475 nm;other metals:Mg2+,Li+,Na+,Ca2+,K+,Ba2+,Zn2+,Cu2+,Sr2+,La3+,Co2+,Ni2+,Pb2+,Cd2+,Al3+,Cr3+,Fe3+

2 結果與討論

2.1 探針1對Hg2+、Ag+離子的識別

為了考察探針1對金屬離子的識別性能，測定了探針1水溶液(10 μmol/L)中分別加入不同金屬離子后的熒光光譜(圖2)。探針1溶液在475 nm處有很強的熒光發射，分別加入0.2 mmol/L的Hg2+或Ag+后熒光猝滅。而在同樣條件下，向探針1溶液中分別加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+,卻幾乎不能使探針1的熒光光譜發生任何變化。這表明探針1可以選擇性識別Hg2+及Ag+。

為了研究其它金屬離子對探針1選擇性識別過程的影響，向存在0.2 mmol/L Hg+或Ag2+的探針1水溶液(10 μmol/L)中分別加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+后測量475 nm處熒光強度(圖3)，結果表明探針1對Hg2+、Ag+的識別基本不受上述其它金屬離子的影響。

圖3 共存金屬離子對探針1識別Hg2+(A)、Ag+(B)的影響Fig.3 Fluorescence response of probe 1(10 μmol/L，H2O) and different coexisting ions of Hg2+(A) or Ag+(B)black bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective metal ions(0.2 mmol/L)；white bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective competing ions(0.2 mmol/L) and Hg2+ or Ag+(0.2 mmol/L)；λex/λem=350 nm/475 nm

2.2 熒光光譜滴定

考察了探針1對Hg2+、Ag+的信號響應情況。向探針1(10 μmol/L，H2O)溶液中分別加入不同濃度的Hg2+或Ag+，發現隨著體系中Hg2+或Ag+濃度的增加，475 nm處的熒光強度逐漸降低。推測Hg2+或Ag+與探針1配位時發生了反向光致電子轉移(Reverse PET)過程，導致熒光猝滅。在加入大約10 μmol/L的Hg2+后光譜趨于穩定，表明探針1與 Hg2+可能以1∶1的方式配位結合(圖4A，內插下圖)。然而加入大約5 μmol/L的Ag+后光譜趨于穩定，表明探針1與Ag+可能是以2∶1方式配位結合的(圖4B，內插下圖)。通過等摩爾連續變化法(Job's-Plot)(圖4，內插圖上圖)也得到探針1與Hg2+及Ag+的結合比分別為1∶1和2∶1，與滴定實驗得到的結果一致。

2.3 比色法檢測Hg2+及Ag+

利用探針可對Hg2+和Ag+的熒光猝滅識別性能進行快速簡便的比色檢測。于365 nm紫外燈下，向探針1(10 μmol/L，H2O)中分別加入 0、5、10、15 μmol/L的 Hg2+，或分別加入 0、2.5、5、10 μmol/L 的 Ag+，通過肉眼觀察發現，隨著離子濃度的增大，探針溶液明亮的藍色熒光逐漸減弱，直至消失(圖5)。這表明探針1能通過目視比色法定性和半定量檢測 Hg2+和Ag+。由于當Hg2+、Ag+的濃度別為5、2.5 μmol/L時熒光強度出現了下降，故該法對Hg2+、Ag+檢出限分別為5、2.5 μmol/L。

2.4 探針1檢測Hg2+及Ag+的分析參數與熱力學參數

線性范圍和檢出限是探針定量檢測的重要指標[21]。如圖4所示，隨著體系中Hg2+或Ag+濃度的增加，475 nm處的熒光強度逐漸降低。結果顯示探針1檢測Hg2+的線性范圍為9.0×10-7～1.1×10-5mol/L，以Hg2+濃度為x軸，熒光強度為y軸進行線性擬合，得到校正曲線方程為y=-635.9x+677.7(r2=0.995 3，n=11)；同樣得到檢測Ag+的線性范圍為8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，校正曲線方程為y=-605.1x+653.0(r2=0.991 9，n=7)。利用檢出限公式(LOD=3σ/s，式中σ為測定10次空白值的標準偏差，s為校正曲線的斜率)得到探針1檢測Hg2+和Ag+的檢出限為分別為1.06×10-8、1.11×10-8mol/L。我國飲用水對Hg2+、Ag+的限量要求分別為0.5×10-8、5.0×10-7mol /L[22]，探針1對Hg2+的檢出限略高于此值，而對Ag+的檢出限低于限量要求。我國污水綜合排放對Hg2+、Ag+的限量要求依次為2.0×10-7、5.0×10-6mol/L[23]，探針1檢測該兩種離子的檢出限可滿足該要求。本文構建的探針與其它報道相比，具有檢出限低和能在純水介質中檢測的優點(表1)。

等溫量熱滴定實驗顯示，探針1與Hg2+和Ag+的作用均為吸熱過程，作用的Ka值依次為6.02×105、1.04×106M-1，計算得出探針1與上述兩種離子的摩爾結合自由能ΔG°(ΔH°-TΔS)分別為-29.93、-33.52 kJ/mol，表明識別過程自發進行。

表1 本文工作與其它報道比較Table 1 Comparison of this work with other literature examples

2.5 探針1檢測Hg2+及Ag+的作用機理

通過核磁滴定實驗考察了探針1分子識別Hg2+和Ag+的作用機理。因探針1在水中溶解的最大濃度達不到該項實驗要求，故選擇在 DMSO-D6溶劑條件下進行實驗。從探針1(1 mmol/L)與Ag+的1H NMR滴定譜圖(圖6)中觀察到，隨著Ag+的加入，位于吡啶基團上的H9質子峰明顯向高場位移(Δδ=-0.09 ppm)，而位于菲啰啉基團上的H2質子峰卻向低場位移(Δδ=0.04 ppm)，這可能是由于羰基氧原子上的孤對電子被Ag+所吸引從而使吡啶基團的電負性增強，而這種電負性變化通過共軛體系傳導進而使菲啰啉基團上的電子云密度減小。由此說明探針1上的羰基氧原子為Ag+提供了作用位點(圖7)，該過程引發了反向光致電子轉移(Reverse PET)，使共軛體系上的電子以非輻射躍遷的方式回到基態，致使探針分子的熒光發生猝滅。探針1(1 mmol/L)與Hg2+的1H NMR滴定譜圖也觀察到類似的現象，說明Hg2+也與羰基氧原子配位(圖7)，引發了Reverse PET過程，不同的是Ag+與兩個探針分子結合而Hg2+只與一個探針分子結合。

圖6 探針1(1 mmol/L)隨著Ag+濃度增加的局部 1H NMR圖( DMSO-D6，298 K)Fig.6 Partial 1H NMR spectra of probe 1 with the increase of Ag+ concentrations( DMSO-D6，298 K)

圖7 探針1對Ag+和Hg2+識別機理猜想Fig.7 Plausible recognition mechanism of the probe 1 towards Ag+ and Hg2+

3 結 論

設計合成了一種新型水溶性菲啰啉熒光探針，并對其性質進行考察。在純水介質中，探針1通過熒光猝滅方式識別Hg2+和Ag+，結合比分別為1∶1和2∶1，檢測的線性范圍依次為9.0×10-7～1.1×10-5、8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，檢出限均低至10-8mol/L。利用探針1與Hg2+和Ag+的作用模式不同可以對其進行區分。根據識別前后的熒光強度變化，建立了裸眼快速檢測Hg2+和Ag+的可視化分析方法。等溫量熱滴定實驗顯示，探針1與Hg2+和Ag+作用的Ka值分別為6.02×105、1.04×106M-1。通過1H NMR滴定探討了探針1檢測Hg2+和Ag+的作用機理，發現離子與探針分子的羰基氧原子配位，引發了Reverse PET過程。該研究為探針1在生物體及環境領域中的潛在應用提供了參考依據。