高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測定化妝品中六價鉻與三價鉻

吳思霖，王欣美，潘 晨，于 建，張 凱，王 柯，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

鉻(Cr)在自然界中主要以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)兩種形態(tài)存在。Cr(Ⅲ)是生物體必需的微量元素，而Cr(Ⅵ)的毒性比Cr(Ⅲ)高100倍，為致畸致癌物質(zhì)[1-2]，易被人體吸收并在體內(nèi)蓄積。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署(IARC)已將Cr(Ⅵ)列為致癌物質(zhì)[3]。不同價態(tài)的鉻毒性差別較大，因此僅對鉻做總量分析不夠完善。由于Cr(Ⅵ)的高致畸致癌性，化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)中規(guī)定鉻、鉻酸及其鹽類(以Cr(Ⅵ)計)為禁用組分，但目前國家尚未制定Cr(Ⅵ)的相關限值。Cr(Ⅵ)在酸性條件下易轉(zhuǎn)變?yōu)镃r(Ⅲ)[4-6]，因此有必要建立一種同時分析Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的方法，為化妝品中鉻的風險評估、相關限值制定奠定基礎。

目前，國內(nèi)對Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)同時檢測的研究主要集中在玩具[4-5]、食品[7-8]、飲用水[9-10]等領域，對化妝品中鉻價態(tài)的研究較少且以檢測總鉻為主，尚缺乏化妝品中鉻價態(tài)檢測的技術(shù)標準。檢測Cr(Ⅵ)或同時檢測Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的方法有原子吸收光譜法[11-13]、離子色譜法[14]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]等，其中高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點，近年來已成為形態(tài)分析中最具應用前景的技術(shù)。

然而文獻多采用酸性溶液提取Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)[4]，將其應用于化妝品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的提取時重現(xiàn)性較差，且Cr(Ⅵ)在酸性條件下易轉(zhuǎn)變?yōu)镃r(Ⅲ)，較難適用于不同基質(zhì)類型化妝品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的同時測定。本文通過優(yōu)化質(zhì)譜、色譜及提取條件等，建立了同時檢測化妝品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的HPLC-ICP-MS分析方法，旨在為化妝品的安全監(jiān)管提供必要的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；WNB10-45 型恒溫水浴搖床(美墨爾特上海貿(mào)易有限公司)；5810R型高速離心機(德國Eppendorf公司)；DELTA 320 型 pH 計(瑞士Mettler公司)；Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國Millipore公司)。

Cr(Ⅵ)標準溶液(1 000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；Cr(Ⅲ)標準溶液(1 000 mg/L，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)；硝酸(色譜純,德國 Merck公司)；EDTA、氫氧化鈉、氨水(均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

混合標準溶液：分別精密移取Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)標準溶液適量，用10 mmol/L EDTA溶液(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))稀釋，配制質(zhì)量濃度為 1 μg/mL的混合標準溶液，于 50 ℃ 水浴中加熱60 min，使Cr(Ⅲ)與 EDTA 完全絡合。

1.2 檢測條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Bio-WAX柱(4.6 mm × 50 mm，5 μm)；柱溫：室溫；流動相：0.075 mol/L 硝酸(pH 7.0，氨水調(diào)節(jié))；洗脫方式：等度洗脫；進樣量：40 μL；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件高頻等離子體發(fā)射功率：1 550 W；載氣：氬氣(99.999%)；載氣流量：0.8 L/min；載氣補償氣流量：0.4 L/min；氦反應碰撞模式；氦氣流量：4.0 mL/min；采樣錐/截取錐：Pt錐；采樣深度：8.0 mm；蠕動泵：0.4 r/min。采集質(zhì)量數(shù)：鉻52；積分時間：0.8 s；采集時間：180 s。

1.3 樣液的制備

稱取0.5 g 樣品置于10 mL 離心管中，加入10 mL 10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))，渦旋混勻后于 50 ℃水浴中加熱60 min，使Cr(Ⅲ)與 EDTA 完全絡合，冷卻，取部分溶液以 10 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。同時，按相同操作方法做空白試驗。

圖1 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液(10 μg·L-1)的HPLC-ICP-MS圖Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatogram of Cr(Ⅵ) and Cr(Ⅲ)(10 μg·L-1) mixed standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用Agilent調(diào)諧液(Li、Y、Co、Ce 和Tl的質(zhì)量濃度為1 μg/L)對儀器進行調(diào)諧，使儀器的靈敏度和穩(wěn)定性最佳。調(diào)節(jié)碰撞反應氣流速，以消除質(zhì)譜檢測中40Ar12C+與35Cl16O1H+對52Cr+的光譜學干擾，同時優(yōu)化載氣流量、補償氣流量及采樣深度等，以提高儀器靈敏度，并使氧化物和雙電荷的比率符合儀器推薦的要求，優(yōu)化的質(zhì)譜條件見“1.2.2”。

2.2 色譜柱的選擇

文獻中采用C18[8]、C8色譜柱[5]和陰離子色譜柱[6]均可實現(xiàn)Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分離，但使用C18、C8色譜柱分離時，流動相中需加入離子對試劑，對色譜柱損傷較大[18]。而陰離子色譜柱耐受性強，應用廣泛，因此本實驗選用陰離子色譜柱Agilent Bio-WAX柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)，對10 μg/L Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液進行分離。結(jié)果顯示，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在3 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離，且峰形尖銳，分離度好(見圖1)。

2.3 pH值的影響

Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在不同 pH 條件下的穩(wěn)定性有較大差異。實驗發(fā)現(xiàn)，當 pH>8.0時，Cr(Ⅲ)的響應信號隨時間延長而逐漸降低；當pH<6.0時，Cr(Ⅵ)的響應信號隨時間延長而逐漸降低，且16 h后其信號損失高達50%。這是由于在堿性條件下，Cr(Ⅲ)易水解生成沉淀，而在酸性條件下，Cr(Ⅵ)易轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)[4-6]。當pH為6.0～8.0時，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)相對穩(wěn)定，但隨著 pH值的升高，Cr(Ⅵ)的保留時間縮短，分離度降低。因此，綜合考慮分離度及分析過程的穩(wěn)定性，選擇流動相及提取溶劑的pH值為7.0。

2.4 前處理條件的優(yōu)化

2.4.2 EDTA濃度的影響分別用0.1、0.5、1、5、10、50、100 mmol/L的EDTA(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))配制1 μg/mL Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液，考察EDTA濃度對Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)分離情況的影響。結(jié)果表明，隨著EDTA濃度的增加，Cr(Ⅵ)的峰面積無顯著變化，但保留時間逐漸縮短，Cr(Ⅲ)的峰面積逐漸增大至穩(wěn)定，兩峰的分離度逐漸降低。當EDTA濃度為10 mmol/L時，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的響應高且分離效果好，因此選擇EDTA的最佳濃度為10 mmol/L。

2.4.3 絡合溫度的影響Cr(Ⅲ)與 EDTA 在常溫下絡合緩慢，需數(shù)十小時才能絡合完全，且升高溫度可加快絡合速度[17]。以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))配制 1 μg/mL的 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液，分別置于 30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中 60 min，考察溫度對Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)響應及穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，Cr(Ⅵ)的響應信號無明顯變化；Cr(Ⅲ)的響應逐漸增加，但溫度達70 ℃后其響應信號顯著下降。綜合考慮，選擇50 ℃為最佳絡合溫度，此時Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的響應均較高。

2.4.4 絡合時間的影響以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))配制1 μg/mL的 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液，置于50 ℃水浴中分別絡合15、30、45、60、90、120 min后進行測定。結(jié)果表明，隨著絡合時間的延長，Cr(Ⅲ)的響應信號逐漸增大，60 min后其響應信號趨于穩(wěn)定，表明此時Cr(Ⅲ)與EDTA 已絡合完全，而絡合時間對Cr(Ⅵ)的響應信號無顯著影響，因此選擇最佳絡合時間為60 min。

2.5 線性關系、檢出限及定量下限

以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH調(diào)節(jié))將Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的混合標準溶液(1 μg/mL)稀釋成 1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標準工作溶液，在優(yōu)化條件下采用本方法進行測定，以各組分的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標，響應值(y)為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)均在0～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(r2)均為0.999 9，回歸方程分別為y=48 471.2x+44 530和y=46 817.2x+305 144。以色譜峰信噪比(S/N)為3時所對應的濃度計算檢出限(LOD)，以S/N為10時所對應的濃度計算定量下限(LOQ)，當進樣量為40 μL時，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的LOD分別為6、2 μg/kg，LOQ分別為18、6 μg/kg。

2.6 加標回收率與相對標準偏差

選用液態(tài)水基類、膏霜乳液類及粉類3種基質(zhì)的空白樣品，分別添加100、400、1 000 μg/kg的Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合標準溶液，按照本方法進行測定。得到3個加標水平下Cr(Ⅵ)的回收率為85.3% ～101%，相對標準偏差(RSD，n=6)為0.4%～2.5%；Cr(Ⅲ)的回收率為85.1%～113%，RSD(n=6)為0.5%～4.6%，方法的準確度和精密度良好。

圖2 粉類基質(zhì)樣品(powder-10)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of powder cosmetics sample(powder-10)

2.7 實際樣品的檢測

按照上述方法對液態(tài)水基類、膏霜乳液類及粉類3種基質(zhì)的30批次實際樣品進行測定，液態(tài)水基類樣品均未檢出Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)；2個膏霜乳液類樣品檢出Cr(Ⅲ)，含量分別為49.90、9.92 μg/kg；5個粉類樣品檢出Cr(Ⅲ)，含量為2.28～155.79 μg/kg；1個粉類樣品同時檢出Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，含量分別為143.20、23.28 μg/kg，該樣品(Powder-10)的色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，實驗所選取的化妝品樣品中鉻多以Cr(Ⅲ)形態(tài)存在，部分樣品檢出Cr(Ⅵ)。

3 結(jié) 論

本研究建立了HPLC-ICP-MS同時測定化妝品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的分析方法。考察了pH值、提取溶劑、EDTA濃度、絡合溫度及絡合時間等條件的影響，最終確定以10 mmol/L(pH 7)的EDTA溶液為提取溶劑，在50 ℃下絡合60 min。在優(yōu)化實驗條件下，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的線性范圍為0～100 μg/L，相關系數(shù)(r2)均為0.999 9，檢出限分別為6、2 μg/kg，加標回收率為85.1%～113%，RSD為0.4% ～ 4.6%。該方法樣品前處理簡單，重現(xiàn)性好，回收率高，適用于化妝品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的定量分析，可為化妝品中鉻的風險評估、相關限值制定奠定基礎。