氧化石墨烯基質毛細管電色譜胰蛋白酶微反應器的性能研究

劉 佳，董 旭，郭 華，王 嫚，申剛義

(中央民族大學 藥學院,民族醫(yī)藥教育部重點實驗室(中央民族大學)，北京 100081)

固定化酶微反應器作為一種微型生化反應工具，具有樣品用量少、催化效率高、可重復利用、易功能化組裝等優(yōu)勢，在蛋白質酶解、生物傳感器、抑制劑篩選等領域得到了廣泛研究和應用[1-3]。而將固定化酶微反應器和高效分離技術在線聯(lián)用，可實現酶解-分離-鑒定一體化平臺操作，顯著提速研究周期。目前，國內外眾多學者對固定化酶微反應器在線高效分離技術進行了大量研究[4-7]。如Zhang等將胰蛋白酶微反應器與μPRLC-ESI-MS/MS聯(lián)用，構建了一個集在線蛋白變性、還原、酶解、分離、檢測于一體的蛋白質分析平臺[4]。相對于其他分離技術，以毛細管為反應及分離通道的毛細管電泳酶微反應器因制作簡便、分離效率高、易于聯(lián)用而優(yōu)勢明顯。研究者將固定化酶微反應器與毛細管電泳在線耦合，開展了從中藥材中篩選酶抑制劑的研究[7-8]。本課題組也基于毛細管電泳酶微反應器，測定了吉非替尼對人表皮生長因子受體的抑制率[8]。毛細管電泳酶微反應器主要由酶微反應器和毛細管分離通道兩部分構成。不同的固酶基質對酶微反應器的性能有很大影響。而不同的毛細管電泳分離模式也直接影響后續(xù)樣品的分離效率。因此開發(fā)新型固酶基質和電泳分離介質對于提高毛細管電泳酶微反應器性能至關重要。

近年來，納米材料作為固酶基質和分離介質逐漸受到研究者的青睞[9-10]，其中石墨烯(Graphene)作為新型納米材料[11-12]廣受關注。石墨烯大的比表面積能增加固酶量，而高電導率可促進酶的催化效率[13]。此外，基于其良好的穩(wěn)定性以及π-π共軛作用等獨特物化性質，石墨烯作為電色譜固相介質可顯著提高分離效率。因此，將石墨烯引入酶微反應器-毛細管電泳技術中，制備石墨烯基質的固定化酶微反應器-毛細管電色譜，既能簡化制作方法，還將提高該技術的整體性能。

雖然石墨烯作為毛細管的固酶基質已有研究[13-14]，但將石墨烯優(yōu)良的固酶性能和分離性能有機結合起來提高毛細管電泳酶微反應器技術整體性能鮮見報道。基于此，本文以石墨烯衍生物氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)為基質，以胰蛋白酶為模型蛋白，通過層層組裝法制備了毛細管電色譜胰蛋白酶微反應器，對其性能進行了研究，并將其應用于中藥材中胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor,TI)的快速篩選。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

P/ACE MDQ型毛細管電泳儀(Beckman Coulter公司)，配紫外檢測器；未涂層熔融石英毛細管(內徑為75 μm，總長為40 cm，有效長度30 cm，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；XP205型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；pH計(Sartorius PB-10)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；NW10VF超純水系統(tǒng)(上海康雷分析儀器有限公司)；RFS100/S傅立葉拉曼光譜儀(Bruker公司)。

GO(片徑50～200 nm，南京先豐納米材料科技有限公司)；牛胰蛋白酶(1∶250，4.0 U/mg，美國Amresco公司)；N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)、N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)、聚乙烯亞胺(PEI，50%水溶液)、芐脒鹽酸鹽(BH)均購于阿拉丁試劑上海公司；10種中藥材(北京同仁堂中關村藥店)；其他化學試劑(國藥集團)除特殊說明外均為分析純；實驗用水為超純水；所用溶液均經0.22 μm尼龍66膜過濾。

1.2 GO毛細管電色譜的制備

裸毛細管內壁依次用1 mol/L NaOH、超純水、0.1 mol/L的HCl各沖洗活化20 min，沖洗壓力為20 psi(1 psi=6.9×103Pa)。活化后的毛細管用5%(體積分數)PEI沖洗20 min使內壁帶正電荷，用超純水反向將未結合的PEI沖洗掉。通入0.5 mg/mL的GO(使用前超聲處理0.5 h)，孵化20 min，重復上述步驟一次，使毛細管內壁帶上負電荷。用超純水反向將未結合的GO沖洗掉。以上正向沖洗壓力均為5 psi，反向沖洗壓力均為10 psi。

1.3 胰蛋白酶微反應器的制備

在GO毛細管電色譜進樣端以0.5 psi的壓力進樣10 s注入一段約1 cm長的5 mg/mL的胰蛋白酶Tris-HCl溶液(50 mmol/L，pH 8.0)。孵化40 min后用Tris-HCl緩沖液反向沖洗10 min，沖洗壓力為10 psi。反應器制備完成后于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥材提取液的制備

分別準確稱量5.0 g各種中藥材，粉碎，加入100 mL 6 mmol/L NaOH溶液，超聲30 min。然后用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至8.0，再超聲1.5 h，傾入高速離心管中，以16 000 r/min高速離心10 min使之分層，棄去不溶物，取上清液過0.45 μm尼龍濾膜，濾液于4 ℃保存待用，臨用時稀釋至所需濃度。

1.5 儀器工作條件

電泳條件：胰蛋白酶微反應器毛細管電色譜柱使用前經Tris-HCl緩沖液沖洗10 min，兩次進樣間運行緩沖液沖洗5 min。樣品進樣量為0.5 psi×5 s，分離電壓20 kV，檢測波長254 nm，實驗溫度25 ℃。系統(tǒng)控制與數據處理由32Karat軟件完成。

酶性能測定條件：不同濃度的BAEE按照上述進樣量導入微反應器柱端，25 ℃下與固定化胰蛋白酶孵化1 min后分離檢測，其他條件同上。通過產物BA峰面積的變化來計算酶活。

抑制率測定條件：10 mmol/L BAEE和5 mmol/L抑制劑BH(或10 mg/mL的中藥材粗提物)的混合液導入胰蛋白酶微反應器柱端，于25 ℃下孵化1 min后分離檢測，其他條件同上。通過添加抑制劑前后產物BA峰面積的變化來計算抑制率：Inhibition(%)=100-(100x/blank);式中，Inhibition(%)為抑制率；blank為加入抑制劑前產物BA的峰面積；x為加入抑制劑后BA的峰面積。

圖1 不同毛細管的EOF隨pH值(7.0～9.0)的變化Fig.1 The variation of EOF with pH range from 7.0 to 9.0 in different capillaries

圖2 GO修飾毛細管(a)和裸管(b)的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of the GO-coated capillary(a)and bare capillary(b)

2 結果與討論

2.1 GO電色譜表征

2.1.1 電滲流選用二甲基亞砜(DMSO)作為電滲流(EOF)標記物，以pH 7.0～9.0的Tris-HCl為運行緩沖液，測定了GO毛細管電色譜的EOF值。結果如圖1所示，裸管的EOF隨著pH值增大而增大；當其表面修飾正電荷的PEI后，EOF反轉為負值；而當進一步修飾GO后，由于GO表面含有羧基負離子，使得EOF回歸正向。通過比較，還可發(fā)現GO修飾的毛細管EOF穩(wěn)定性在pH 7.0～9.0范圍內有明顯改善。

2.1.2 拉曼光譜采用拉曼光譜對其結構進行表征。由圖2可見，毛細管修飾GO后顯示出了兩個特征峰D帶(1 335 cm-1)和G帶(1 610 cm-1)，表明GO已成功修飾在毛細管內壁。

2.1.3 穩(wěn)定性分別考察了GO柱在同一天內多次測定(n=5)、多天測定(n=5)及不同批次GO柱(n=3)電滲流的穩(wěn)定性，結果顯示，其相對標準偏差(RSD)均小于5%，表明所制備的毛細管電色譜具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 分離性能

以胰蛋白酶的底物BAEE和產物BA的混合物為分離對象，考察GO毛細管電色譜的分離能力。結果發(fā)現，GO毛細管電色譜分離度(R)為4.71(n=3)，而裸毛細管為3.70(n=3)。由此可見，GO的引入可使分離效果明顯提高，有望進一步應用于復雜化合物的分離。

2.3 酶微反應器的性能

在GO毛細管電色譜的基礎上制備了固定化胰蛋白酶微反應器，并考察微反應器的性能。

2.3.1 穩(wěn)定性將5 mmol/L BAEE底物通入反應器，孵化1 min后進行分離檢測。以產物BA初始峰面積為定量指標，考察微反應器的穩(wěn)定性。結果顯示，新制備的微反應器前8次峰面積呈波動式下降，這可能與未結合的酶流失有關。從第9次后趨于穩(wěn)定，RSD為3.8%(n=10)。2日內連續(xù)測定20次RSD為1.8%。不同批次間RSD為2.3%(n=3)。

圖3 孵化時間對產物率的影響Fig.3 Effect of incubation time on product BA

2.3.2 孵化時間考察了反應器不同孵化時間對酶活的影響(圖3)。結果顯示，隨著孵化時間的延長，產物BA量逐漸增加，表明酶的水解活性提高。當孵化時間達到8 min后，BA量最大且不再增加。由于孵化時間過長會造成樣品區(qū)帶的擴散，不利于分離，且分析時間也會延長，綜合考慮將孵化時間選為1 min。

2.3.3 酶活性能反應器的酶活性能主要通過米氏常數(Km)和最大反應速率(Vmax)進行評價。本研究計算得固定化胰蛋白酶微反應器的Km=1.10 mmol/L，Vmax=0.32 mmol·L-1·s-1。同時，利用靜電作用在裸毛細管中固定胰蛋白酶，在相同實驗條件下，固定化酶的Km為109.77 mmol/L，Vmax為0.000 46 mmol·L-1·s-1。對比可知，采用GO作為固定酶基質的固定化酶的Km遠小于裸管，Vmax遠大于裸管。表明GO的引入顯著提高了固定化酶的親和力和對底物的催化活性。原因可能是GO具有獨特的單原子厚度，其二維的平面結構提供了極大的比表面積，可以用來負載大量的各種分子，將其作為固酶載體，利于胰蛋白酶的固定。并且表面含有豐富的含氧基團，有利于提高酶的固載量，從而改善了酶微反應器的性能。

2.4 實際應用

胰蛋白酶抑制劑(TI)是對胰蛋白酶具有抑制作用的一類物質，臨床上廣泛用于治療胰腺炎、休克和腦外科、手術止血、腫瘤等。利用胰蛋白酶作為篩選TI的靶標，從中藥材提取物中篩選出活性藥物具有非常重要的意義。本研究將所制備的酶微反應器用于實際藥材中TI活性成分的篩選。圖4為已知抑制劑BH和三七粗提液添加前后對胰蛋白酶抑制的電泳分離圖。從圖4A可知，加入BH后產物BA峰面積與未加前相比明顯降低，而底物BAEE峰面積則相對增大。表明BH的加入有效抑制了胰蛋白酶對BAEE的水解。三七也有類似的結果(圖4B)。

表2列出了對市售10種中藥材的篩選結果，發(fā)現三七、大黃對胰蛋白酶有抑制作用，其它中藥材則無抑制，與文獻報道結果一致[15-16]，表明該方法可以用于藥材中酶抑制劑的快速篩選。抑制率計算結果與文獻中存在差異主要是由于孵化溫度的不同導致。

SampleInhibition(%)SampleInhibition(%)Pseudo-ginseng(三七)26Phellodendron(黃柏)0FreshRehmanniaeRadix(鮮地黃)0Rheumofficinale(大黃)26.12Radixangelicaesinensis(當歸)0Atractylodesmacrocephala(白術)0BH53.5Codonopsispilosula(黨參)0Lonicerajaponica(金銀花)0Scropularianingpoensis(玄參)0Dioscoreaopposita(山藥)0

3 結 論

本文基于GO兼具良好的分離能力和固酶性能，構筑了GO功能化的毛細管電色譜胰蛋白酶微反應器，并利用該反應器從10種中藥材中篩選出2種有胰蛋白酶抑制劑成分的中藥材(三七和大黃)。該研究既為毛細管電泳酶微反應器的制備方法拓展了思路，也為酶抑制劑篩選快速提供了一種簡便的技術。