流式熒光技術(shù)聯(lián)合檢測多種腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用

梁仲城* 李春麗 周培剛 黃艷云

（廣西百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000）

近年來惡性腫瘤已成為疾病死因之首，其發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢[1]。全國腫瘤登記中心主任陳萬青發(fā)布的2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年中國有4292000例新發(fā)惡性腫瘤病例和2814000例死亡病例。早期診斷并早期治療是降低惡性腫瘤患者病死率、提高惡性腫瘤患者生存質(zhì)量的重要途徑，探尋一種惡性腫瘤早期診斷的方法一直是醫(yī)學(xué)界所關(guān)注。腫瘤標(biāo)志物檢測對診斷和篩查惡性腫瘤有一定的參考意義，可單一指標(biāo)檢測存在靈敏度低特、異性不強(qiáng)等不足[2]，多種聯(lián)合檢測可顯著提高檢測靈敏度和特異性，對腫瘤的早期診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。流式熒光技術(shù)具有高速度、高通量、可并行檢測的生物技術(shù)平臺[3]，它有機(jī)地整和了編碼微球（color-coded beads）、應(yīng)用流體學(xué)、激光技術(shù)、高速數(shù)字信號處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了其極高的檢測特異性和靈敏度，廣泛應(yīng)用于核酸研究、酶學(xué)分析、免疫分析、受體和配體識別分析等研究[4]。本研究對本實(shí)驗(yàn)室?guī)啄陙硎褂蒙虾Ｍ妇吧萍脊煞萦邢薰咎峁┑腖uminex 200多功能流式點(diǎn)陣檢測系統(tǒng)檢測的421例惡性腫瘤患者、372例良性疾病患者和154例健康體檢者血清中常見的7種腫瘤標(biāo)志物既AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等含量數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，探討多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測在臨床應(yīng)用的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：惡性腫瘤組421例均為百色市人民醫(yī)院2012年10月至2016年12月住院及門診患者，其中肝癌109例、胃癌97例、肺癌56例、結(jié)直腸癌59例、胰腺癌19例、卵巢癌46例、宮頸癌35例，其中男246例，女175例，年齡23～90歲，平均年齡53歲，均經(jīng)影像學(xué)及組織病理學(xué)等相關(guān)檢查確診；良性疾病組372例為同期住院及門診患者，其中男182例，女190例，年齡18～92歲，平均年齡52歲；健康體檢組為健康體檢者154名，年齡16～90歲，平均年齡48歲。

1.2 儀器和試劑：上海透景生命科技股份有限公司提供的多功能流式點(diǎn)陣儀（Luminex 200）及配套試劑。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本采集：空腹采外周靜脈血3 mL，無溶血、無脂血3000 r/min（離心半徑為16 cm）離心8 min，分離血清當(dāng)天送檢。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法：嚴(yán)格按上海透景公司提供的《多種腫瘤標(biāo)志物（7種）定量檢測（流式熒光發(fā)光法）試劑說明書》進(jìn)行操作。

1.3.3 正常參考范圍，見表1。

1.3.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：超過臨界值即為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：多項(xiàng)分析結(jié)果中有一項(xiàng)以上結(jié)果陽性者計(jì)為陽性病例結(jié)果均正常者計(jì)為陰性病例，分組別統(tǒng)計(jì)陽性例數(shù)，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以率表示計(jì)數(shù)資料，顯著性檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 惡性腫瘤組與良性疾病組、健康體檢組陽性率的比較：多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測惡性腫瘤組陽性率為73.63%；良性疾病組陽性率為28.77%；健康體檢組陽性率為7.23%。惡性腫瘤組陽性率顯著高于良性疾病組和健康體檢組（χ2=159.48，P＜0.01，χ2=202.14，P＜0.01）。各種腫瘤標(biāo)志物在各組檢測陽性率見表2。

表1 7種腫瘤標(biāo)志物正常參考范圍

表2 各種腫瘤標(biāo)志物在各組中陽性率的比較（%）

2.2 腫瘤組與非腫瘤組（良性疾病組和健康組）多種聯(lián)合檢測陰陽性例數(shù)比較：多種聯(lián)合檢測檢出惡性腫瘤陽性預(yù)測率為73.63%（310/421）；陰性預(yù)測率為77.57%（408/526）；靈敏度為72.43%（310/428）；特異性為78.61%（408/519）。

表3 多種聯(lián)合檢測腫瘤組與非腫瘤組（良性疾病組和健康組）陰陽性例數(shù)比較

3 討 論

惡性腫瘤在我國人口中的病死率為108.39/10萬，占總死亡人數(shù)的17.9%，高居死亡原因的第2位。由此可見早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷并早期治療對腫瘤患者具有重要意義。由于目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物多為腫瘤相關(guān)抗原，這類腫瘤相關(guān)抗原并不是腫瘤細(xì)胞所特有，正常組織和細(xì)胞也有表達(dá)，只是表達(dá)的量存在差異，某些良性疾病也會(huì)有不同程度的升高，不同種腫瘤也可存在相同的腫瘤標(biāo)志物，一種腫瘤也可以存在多種腫瘤標(biāo)志物。因此單一標(biāo)志物檢測存在著特異性不強(qiáng)，陽性率較低等不足，特別是早期腫瘤的檢出率不高等缺點(diǎn)。多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以克服這一缺點(diǎn)[5]。

本實(shí)驗(yàn)使用Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀檢測7種腫瘤標(biāo)志物。試劑中7種不同的熒光編碼微球上分別交聯(lián)針對AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等7種腫瘤標(biāo)志物單克隆抗體，并以一定數(shù)量混合。血清中的各種腫瘤標(biāo)志物就會(huì)被對應(yīng)的微球捕獲，然后加入生物素標(biāo)記的熒光的針對上述各種腫瘤標(biāo)志物配對抗體及鏈親和素標(biāo)記的PE混合物。這樣各熒光編碼的微球上就形成了與微球抗體交聯(lián)的抗體-腫瘤標(biāo)志物-生物素標(biāo)記的配對抗體-鏈親和素標(biāo)記PE結(jié)合物，在多功能流式點(diǎn)陣儀上這些熒光微球在流動(dòng)鞘液的帶動(dòng)下單列依次通過紅綠激光，紅色激光用來判定微球的熒光編碼，綠色激光用來測定微球上相應(yīng)腫瘤標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與測定成分含量成正比，從而達(dá)到快速準(zhǔn)確定量檢測的目的。流式熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測幾種蛋白含量，具有使用標(biāo)本量少、同時(shí)多種項(xiàng)目檢測、操作簡單、高通量、線性范圍廣、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。目前，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測[6-8]，本研究結(jié)果表明，使用流式熒光技術(shù)聯(lián)合檢測AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等7種腫瘤標(biāo)志物檢出惡性腫瘤陽性預(yù)測率為73.63%；陰性預(yù)測率為77.57%；靈敏度為72.43%；特異性為78.61%。惡性腫瘤組聯(lián)合檢測陽性率為73.6%顯著高于良性疾病組（陽性率28.77%）和健康體檢組（陽性率7.23%）（P＜0.01）。這與李心河等報(bào)道的使用C-12型多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)測定分析12種常見腫瘤標(biāo)志物惡性腫瘤組的陽性率（85.6%）顯著高于良性疾病組（41.2%）及健康體檢組（7.03%）結(jié)果相近[5]。究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：惡性腫瘤各組聯(lián)合檢測陽性率最高為肝癌組84.40%、其次為胰腺癌組84.21%、再次為卵巢癌組76.09%、陽性率最低為宮頸癌組57.14%。各組聯(lián)合檢測陽性率均高于單一標(biāo)志物檢測陽性率。其中肝癌組、肺癌組、結(jié)直腸癌聯(lián)合檢測陽性率與對應(yīng)的單一標(biāo)志物檢測陽性率比較具有顯著性（P＜0.01），見表2，研究結(jié)果與馬經(jīng)野等報(bào)道的采用蛋白芯片系統(tǒng)聯(lián)合測定分析12種腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合檢測對肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、食管癌檢出陽性率均顯著高于其單一腫瘤標(biāo)志物檢測（P＜0.01）[9]結(jié)果相符合。

研究還發(fā)現(xiàn)，AFP+CA125+CEA對肝癌診斷的價(jià)值較大，CEA+CA125+CA242對消化道惡性腫瘤的診斷陽性率較高，CEA+CA125+CYFRA211（或NSE）聯(lián)合診斷有助于肺癌的早期診斷。同時(shí)從表2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)CEA和CA125屬于廣譜的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，它們在不同腫瘤疾病中都有升高，在一些消化系統(tǒng)良性疾病和婦科良性疾病中也常常會(huì)升高，所以良性疾病組和健康體檢組也會(huì)出現(xiàn)部分CEA或CA125升高的情況。

綜上所述流式熒光技術(shù)具有多項(xiàng)目同時(shí)檢測、使用標(biāo)本量少、操作簡單、高通量、線性范圍廣、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[10]。使用流式熒光技術(shù)多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測對腫瘤檢出陽性率高于其單一腫瘤標(biāo)志物檢測，對提高腫瘤檢出率和腫瘤早期診斷具有重要的臨床意義。