替吉奧下調大鼠胃癌前病變組織Notch1和Jagged1的表達

王英杰 王 晶

(承德醫學院，承德 067000)

胃癌現在已經成為全世界都關注的健康問題，截至目前，胃癌的發病人數仍以每年90多萬例的數量持續增加，并且每年的死亡人數也達到了70多萬例，占據了全球死亡人數的第二位[1]，給人們的健康生活以及經濟都帶來了巨大的損失，是消化道最多見的惡性腫瘤。在中國，其發病率占消化道惡性腫瘤的首位，約占世界發病率的52%。針對胃癌，目前最有效的治療措施就是根治性的切除手術，但是由于胃癌的早期發病癥狀并不十分明顯，所以大多數患者在發現病情時就已經錯過了最佳的治療時間。而對于晚期的胃癌患者，化療是最有效的延長患者生命的治療手段[2]。所以認識胃癌的發病機制，對于胃癌特異性抗癌藥物的研發和胃癌的治療都具有重要意義。

Notch信號通路在胃癌的整個發生過程中都起到了重要的作用，這其中就包括Notch信號通路出現表達升高時，胃腺上皮細胞會出現大量的增殖，進而引起凋亡下降，然后由于上皮表型的惡性轉化致使癌變發生[3]。已有學者在胃癌的研究中發現，Notch的配體Jagged1和人體的侵襲型胃癌具有密不可分的關系[4]。胃癌組織Jagged1表達上升的患者的生存率比無Jagged1表達的患者低[5]。學者們發現NF-κB的過量表達，能夠造成Notch信號通路失調介導，是導致胃癌發生、發展的主要機制[6]。本實驗通過建立大鼠胃癌模型，使用替吉奧對其進行干預治療，檢測Notch信號通路的相關蛋白表達，為臨床治療提供可靠的實驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 實驗室用動物：選用健康的雄性清潔級大鼠，6～8周齡，重量220～240 g。所有實驗用的大鼠均購于北京維通利華動物公司，大鼠取回后能夠自主地進食進水，動物存放室的溫度一般控制在(25±2)℃左右，濕度大約在(40±5)%左右，在進行動物實驗之前要按照SPF級的動物準則喂養5～7 d。替吉奧購自山東新時代藥業有限公司，瓊脂糖和RIPA購自Yeasen公司，β-actin購自Santa cruiz公司，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosog-uanidine,MNNG)購自湖北遠成賽創公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型建立 用100 μg/ml的MNNG混懸液進行灌胃，混懸液里藥品濃度為：2 ml/100 g 體重，每間隔1 d進行1次，持續灌胃30 d，并且每3 d使用1.5 ml的純乙醇強行進行灌胃，在進食2 d后斷食1 d，在斷食的同時要保證大鼠自主服用20 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液，每5～7 d 使用夾子擒住大鼠尾部1～2次，這能夠讓大鼠保持一個相對亢奮的情緒，每次刺激持續10 min，連續進行4周；以上的每個實驗組均喂養4周。并于制作模型完成之前隨機選取每組大鼠6只給予胃黏膜的病理形態學檢查，在這6只被檢測鼠中，只要5只大鼠出現有輕、中度的非典型增生，就可以認為是制作模型成功。將60只大鼠隨機取等分為3組：對照組、模型組、替吉奧治療組。替吉奧治療組給予替吉奧治療，用藥量0.5 mg/g。

1.2.2大鼠胃組織的取材 觀察大鼠的精神狀態、活動度、毛發光澤度、攝食及死亡情況。每周稱2次體重，觀察體重變化。給藥第85天，所有大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體重，腹腔注射)麻醉大鼠后，將大鼠的胃取出，然后沿著胃的大彎將胃慢慢剪開，這個操作的順序是：胃底、胃體、小彎、幽門、賁門處分別取材，4%中性甲醛固定。

1.2.3PCR檢測Notch1和Jagged1的基因表達 組織總RNA的提取：取膀胱組織約100 mg，將組織剪碎后放入到勻漿器內，加入1 ml預冷的Trizol，將組織打碎，裝入1.5 ml EP管中；加入300 μl的氯仿，充分混勻，12 000 r/min，4℃離心15 min；抽取上層水樣400 μl轉移到清潔的EP管中，加入400 μl異丙醇，12 000 r/min，4℃離心15 min，離心結束后緩慢將上清倒掉，留取沉淀物；使用預冷的75%乙醇，清洗1次，然后7 000 r/min，離心5 min；使用無酶槍頭，將75%乙醇吸凈，室溫的狀態下靜置5～7 min，使乙醇充分揮發，剩余的沉淀加入25 μl RNase-free水進行溶解。

PCR擴增：PCR反應體系體積為50 μl，反應體系內容含有：反應緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、上下游引物及逆轉錄反應產物cDNA等，其中上下游引物各1 μl，模板cDNA為3 μl。加樣完成后振蕩混勻，瞬時離心后，置于PCR儀擴增。建議反應條件為：94℃變性20 s，55℃退火30次，72℃延伸30 s，循環30次，72℃延伸30 s。

擴增產物瓊脂糖凝膠電泳：使用1%瓊脂糖凝膠，用Gelstain染料和凝膠成像系統顯色并采集圖片。使用IPP圖像分析軟件進行半定量分析測定，測量條帶灰度值，目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值即為該目的基因的相對表達水平，引物見表1。

1.2.4Western blot檢測Notch1、Jagged1的蛋白定量 將獲取的大鼠胃組織從-80℃超低溫冰箱中取出，然后將胃組織剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低溫離心15 min，然后SDS-PAGE電泳分離后，轉移至 PVDF膜上。5%脫脂奶粉 37℃ 封閉 1.5 h，一抗孵育，并在4℃環境下過夜，第2天二抗孵育2 h。用ECL顯色液進行曝光，使用Image J軟件進行分析，以β-actin作為內參進行半定量分析。

2 結果

2.1實驗大鼠的基本生理數據 對照組中的大鼠進食多，肥胖，靈活，毛色光亮；模型組與對照組相比大鼠出現消瘦，不愛活動，毛色灰暗，進食少，大便稀溏；替吉奧組大鼠與模型組大鼠相比食量正常，背毛光澤度欠佳，體重增加，大便成形，見表2。

2.2PCR檢測結果 應用PCR實驗的方法檢測的結果顯示，在對照組中，Notch1和Jagged1 mRNA僅有少量的表達。與對照組相比，模型組表達均上升(P<0.05)。與模型組相比，替吉奧組表達顯著地下降，但是仍高于對照組的表達(P<0.05)，見圖1、表3。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

表2 各組大鼠的體重指標Tab.2 Body weight of rats in each group

圖1 PCR檢測各組Notch1和Jagged1的表達Fig.1 Detection of mRNA expression levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

表3 PCR 檢測Notch1和Jagged1在各組中的相對定量表達Tab.3 Relative expression detection of mRNA levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

2.3Western blot檢測結果 Notch1的分子量是120 kD，Jagged1的分子量是150 kD。Notch1和Jagged1的Western blot檢測結果顯示，在對照組中，Notch1和Jagged1蛋白僅有微量的基礎表達，與對照組相比，模型組的蛋白表達均顯著地上升(P<0.05)，與模型組相比，替吉奧組的蛋白表達下降，但是仍高于對照組的表達(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 Western blot檢測各組Notch1、Jagged1的表達Fig.2 Detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

表4 Western blot 檢測Notch1和Jagged1在各組中的相對定量表達Tab.4 Relative expression detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

3 討論

胃癌的發病是一個很復雜的過程，這其中有細胞的增殖等方面的參與，是一個多發因素共同作用的結果[7]。平時不健康的飲食習慣、幽門螺桿菌的感染、基因性質的改變都會成為胃癌發生的誘因。胃癌的發生發展是從胃黏膜良性病變向惡性病變逐步演變的過程，也就是說，是由慢性萎縮性胃炎到胃黏膜癌前病變的過程。近年國內外對胃癌的研究熱度都呈現上升的趨勢，這也說明人們對胃癌的重視程度在逐漸地加深[8]。

替吉奧最早是由日本醫藥公司研制，并于20世紀末上市[9]。它的適用范圍是胃癌及頭頸部癌。截至目前，替吉奧在日本已經是治療晚期胃癌不可或缺的主要力量。替吉奧在2009年才在中國研發成功[10]。在替吉奧出現以前，氟脲嘧啶在處理消化道腫瘤過程中占據主導位置。但是由于其半衰期比較短，這就在很大程度上降低了氟脲嘧啶的抗癌作用效果，因此在臨床實際使用過程中，通常采用靜脈滴注的方式來延長氟脲嘧啶的藥效，這一弊端導致氟脲嘧啶在臨床的實際使用中出現了很大的局限性。針對這一問題，替吉奧膠囊成為新一代的氟脲嘧啶類口服抗癌藥物，他的出現將完美地彌補氟脲嘧啶半衰期短的弱點。

本實驗采用體內灌胃法建立大鼠胃癌前病變模型，相對真實地模擬和還原了胃癌在臨床中的實際發病過程。然后將大鼠胃組織從體內分離出來，進行蛋白定量和基因方面的檢測。PCR檢測結果顯示，治療組Notch1和Jagged1 mRNA的表達與模型組相比明顯下降，這也表明替吉奧的藥物治療發揮作用；Western blot檢測結果顯示，治療組蛋白的表達相比與模型組顯著地下降，這也進一步說明了替吉奧對胃癌前病變的治療發揮了作用。

綜上所述，本實驗通過制備大鼠的胃癌模型，采用替吉奧進行干預治療，得到了顯著的治療效果，為臨床治療提供了實驗以及理論依據。