開菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefiri)KL22體外益生特性分析

趙 彤,王永霞,荀一萍,艾連中,趙林森,王立峰,朱 宏,王世杰

(1.河北工程大學,河北邯鄲 056001; 2.石家莊君樂寶乳業有限公司,河北石家莊 050221; 3.上海理工大學,上海 200093; 4. 河北一然生物科技有限公司,河北石家莊 050800; 5. 南京財經大學,江蘇南京 210046)

益生菌被定義為“當攝入足夠數量時,對宿主有健康作用”的活的微生物[1]。其可通過改善免疫應答,產生抗菌物質和益生物質來發揮益生作用[2]。目前研究較多的益生菌為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬,尤其是乳桿菌屬,其作為口腔及腸道內最常見的微生物菌群,能夠顯著抑制有害菌的生長,被認為是一種具有應用價值的益生菌[3-5]。篩選益生菌除了要考慮功能性外,還應考慮安全性,而研究益生菌的體內活性成本高且費時,因此一般采取體外實驗對菌株益生活性進行研究。

發酵食品是獲得優質益生菌的重要來源之一,如酸菜、開菲爾、奶酪等均可分離獲得具有潛在應用價值的益生菌[6-7]。開菲爾乳桿菌是開菲爾發酵乳中的主要組成之一,具有悠久的食用歷史。近年來對開菲爾乳桿菌的研究發現,其具有調節腸道菌群、抑制有害菌等多種益生作用[8-9]。而國內對于開菲爾乳桿菌的研究也在逐漸增多,主要側重于開菲爾乳桿菌的分離和開菲爾粒中復合菌株發酵乳的研究[10-11]。本研究前期從波蘭開菲爾粒中分離獲得一株開菲爾乳桿菌KL22,具有較好的耐酸能力、耐膽鹽能力、粘附能力等,現對其體外疏水性、自凝聚力、降膽固醇能力、抗生素敏感性等進行研究,旨在確定其益生特性,為開發安全多功能益生菌和微生物制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

開菲爾乳桿菌KL22 本實驗室從開菲爾粒樣品中分離保藏,中科院微生物研究所鑒定保存,專利保藏號CGMCC9669;人結腸癌腺細胞系Caco-2細胞株 由四川大學華西公共衛生學院提供,液氮保存;TC含量測定試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司;RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、Real Time PCR試劑盒 天根生化科技有限公司;抗生素標準品(具體見1.2.8) 中國食品藥品鑒定研究所提供。

SPX-250BS-Ⅱ生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺上海新苗醫療器械制造有限公司;CX31顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社;冷凍離心機 賽默飛世爾科技公司;生物安全柜、CO2培養箱 賽默飛世爾科技有限公司;倒置顯微鏡 株式會社尼康;pH計 梅特勒-托利多集團;紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基及菌懸液的制備

1.2.1.1 MRS改良培養基的制備 葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、牛肉浸粉0.5%、無水乙酸鈉0.5%、C6H17N3O70.2%、K2HPO4·3H2O 0.2%、吐溫-80 0.1%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025%、瓊脂1.5%,pH調為6.2,121 ℃,15 min滅菌。

1.2.1.2 含膽固醇改良MRS液體培養基(改良MRS-CHOL)的制備 精確稱取膽固醇0.1 g,用少量無水乙醇溶解并定容至10 mL,終濃度為10 mg/mL,用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾除菌后,按照1%的量加入到改良MRS液體培養基中,使其膽固醇終濃度為0.1 mg/mL。

1.2.1.3 DMEM完全培養液的制備 90% DMEM培養液、10%胎牛血清、1%青-鏈霉素,混合均勻。

1.2.1.4 菌懸液的制備 將KL22按1%接種量轉接于改良MRS培養基,37 ℃培養24 h,轉接培養2代后用PBS洗滌并調整菌濃度至106～108CFU/mL;滅活組為95 ℃水浴10 min[12]。

1.2.2 菌株的生長曲線測定 將KL22按2%的接種量接種到50 mL的改良MRS培養基中,于37 ℃靜置培養,每隔4 h取出3 mL菌液,測定在600 nm波長下的吸光度值,另以未接種的滅菌改良MRS培養基為吸光度測定的空白液。平行測定3次,取平均值。以培養時間為橫坐標,以OD600值為縱坐標繪制菌株生長曲線[13]。

1.2.3 菌株的產酸能力測定 將轉接培養2次的KL22接種于改良MRS培養基,37 ℃恒溫培養,每隔4 h測定培養液的pH,平行測定3次,取平均值[14]。

1.2.4 菌株表面疏水性的測定 用BATH(碳烴化合物黏著法)對菌株表面疏水性進行測定:將KL22轉接培養2次,取5 mL菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體。以5 mL PBS緩沖液洗滌菌體2次,以PBS緩沖液為空白對照,調整菌懸液濃度至OD600值約為0.50左右,記為A0。取3組3 mL調整好濃度的菌液分別置于10 mL無菌離心管,加入1 mL不同的有機溶劑(3組分別為二甲苯、三氯甲烷和乙酸乙酯),室溫靜置5 min,旋渦振蕩2 min,室溫繼續靜置30 min,待液相分層后取水相,測OD600值,記為A1。按下列公式計算菌株表面疏水性[15]。重復3次,取平均值。

細胞表面疏水性H(%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.5 菌株自凝聚力的測定 將KL22轉接培養2次,取5 mL菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體,10 mL PBS洗滌2次后重懸。以PBS為空白對照,調整菌懸液濃度至OD600值約為1.00。取4 mL調整好濃度的菌懸液于離心管中,室溫靜置,分別在靜置1、2、3、4、5 h后吸取3 mL上層溶液測定600 nm吸光值,分別記為A1、A2、A3、A4和A5,按下列公式計算菌株自凝聚能力[16]。重復3次,取平均值。

菌株自凝聚能力(%)=[1-(At/A0)]×100

式中：A0和At分別是自凝聚前后上清液在600 nm下測定的吸光度值。

表1 實時熒光定量PCR引物Table1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.2.6 菌株降膽固醇能力的測定 將KL22于37 ℃培養36 h,OD600處測定菌懸液的吸光值。PBS洗滌1次,收集菌體。滅活組為95 ℃水浴10 min。后取2 mL改良MRS-CHOL重懸菌體,加到9 mL改良MRS-CHOL中,于37 ℃下厭氧培養24、48 h。另做無菌改良MRS-CHOL對照[12]。培養完成后,9000 r/min離心10 min,收集上清,參照TC含量測定試劑盒說明書檢測。

1.2.7 菌株誘導Caco-2細胞中基因的表達實驗

1.2.7.1 細胞與菌體共培養 將1 mL液氮凍存的Caco-2細胞(細胞濃度1×106個/mL)接種于DMEM完全培養液,37 ℃,5% CO2培養箱中恒溫培養,待Caco-2細胞融合度達到90%左右時,去除培養液。用DMEM培養基調整KL22的菌濃度分別為106、108CFU/mL,后與Caco-2細胞在37 ℃細胞培養箱中共培養3 h,用無菌PBS對實驗組(KL22作用)和對照組(無KL22作用)的Caco-2細胞沖洗2次,收集細胞[17]。參照總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取Caco-2細胞總RNA。

1.2.7.2 引物設計 免疫相關基因IL-8、TNF-α、BD-2和內參基因gapdh由上海生物工程公司設計合成[17]。

1.2.7.3 Real Time PCR反應條件 參照天根生化科技有限公司KR106說明書,將所提取的Caco-2細胞總RNA反轉錄獲得cDNA。后參照天根生化科技有限公司FP205說明書進行Real Time PCR反應。

1.2.7.4 結果分析 每個待測樣品均進行3次重復實驗,根據待檢基因的Ct值,利用2-ΔΔCt法對目的基因的相對表達量進行分析,計算當結果大于1時，則認為上調了基因的表達量，當結果等于1時，則認為基因的表達量未發生變化，當結果小于1時，則認為下調了基因的表達量[18]。

2-ΔΔCt=2-[(Ct gene of interest-Ct internal control)sample A-(Ct gene of interest-Ct internal control)sample B]

1.2.8 藥敏實驗 采用K-B法測定了菌種對30種抗生素的敏感性[19]。將活化的菌液在固體MRS培養基上劃線后37 ℃進行培養,挑取單菌落于生理鹽水中,稀釋到濃度為0.5 McFarland濁度(相當于所接種的菌量為1×108CFU/mL)。取300 μL上述菌懸液在整個Mueller Hinton培養基表面進行涂布,待培養基表面的菌液完全晾干后,貼上抗生素紙片,置于37 ℃過夜培養,然后測量抑菌圈的直徑。根據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準判定為耐藥(resistant)、中介(intermediate)、以及敏感(sensitive)[19]。

2 結果與分析

2.1 KL22生長曲線繪制結果

為確保實驗用菌株的質量,以培養時間為橫坐標,菌液OD600值為縱坐標繪制了KL22的生長曲線,如圖1。

圖1 KL22的生長曲線Fig.1 Growth curves of strain

由圖1可看出,菌株KL22的曲線可分為3個階段:延遲期為0～8 h,此時期的菌株數目增加不明顯;對數生長期為8～76 h,經延遲期的準備,為菌株的生長提供了足夠的物質基礎,同時,外界環境也是最佳狀態,因此,在此時間段菌株KL22增殖迅速;76 h后菌株進入穩定生長期[13]。因此,選取培養8～76 h的KL22進行實驗。

2.2 KL22產酸能力分析

產酸能力是篩選乳酸菌的一個重要指標,發酵所產的乳酸能夠賦予乳制品特征性的酸味,因此,菌株的產酸性能越強,說明其性能越佳[14]。此外,在酸性條件下,可抑制李斯特桿菌、沙門氏菌等致病菌的生長[20]。以培養時間為橫坐標,培養基pH為縱坐標繪制KL22的產酸曲線,如圖2所示。

圖2 菌株KL22的產酸能力與培養時間的關系Fig.2 Relationship between acid-producing ability and culture time of strain KL22

由圖2可知,菌株KL22的發酵液pH隨培養時間的延長呈現出先迅速下降后趨于平緩的特點。在培養0～8 h時幾乎無變化,在8～76 h時,發酵液的pH開始快速下降,該時期菌株處于對數生長期,菌株快速繁殖,故開始大量代謝酸性物質。培養76 h后,菌株的pH基本保持穩定,為4.3左右,這與菌株處于穩定期有一定關系。

2.3 KL22的疏水性分析

過菌懸液和有機溶劑(包括二甲苯、三氯甲烷和乙酸乙酯)的混合、振蕩和靜置,對菌株進行表面疏水性測定。由圖3a知,菌株的油水分層較為清楚,菌株與二甲苯混合的結果明顯比三氯甲烷的要渾濁,這與測定的疏水性相符,而菌株與乙酸乙酯混合的分層效果較其它兩種有機溶劑要差,其疏水性也要差一些。

圖3 KL22疏水性測定結果Fig.3 Cell surface hydrophobicity of KL22

在益生菌體外篩選中,菌體表面疏水性的大小反映菌體在體內定植的能力強弱[15]。由圖3b可知,KL22對三種有機溶劑都有一定的細胞表面疏水能力,但疏水結果有所不同。其中,對三氯甲烷的吸附能力最強,高達98.5%,對二甲苯的吸附能力高于對乙酸乙酯的吸附能力,分別為91.62%和82.64%。與閆劉慧[21]研究的5株乳酸菌相比,KL22的疏水性均高于K4H3、K4H2、K3H1等,表明KL22具有較高的疏水性,具有在腸道細胞表面定植的潛力。

2.4 KL22的自凝聚能力分析

對菌株自凝集率的測定結果見圖4a,菌株在靜置時間下OD600值的變化見圖4b,將圖4a和4b結合,可以更加直觀地看出,菌株的OD600值隨著靜置時間的增加呈現出下降趨勢,而菌液自凝集率呈現上升趨勢。菌液自凝集率的上升趨勢并不是一條直線,在1 h內,自凝集率最強,振蕩后明顯沉降。1 h后,KL22的自凝集率達到17.18%,在5 h后,自凝聚率達到21.17%。夏海燕[16]研究了4株乳酸菌的自凝聚能力,結果表明,接種4 h后的自凝聚率范圍為7.2%～28.1%。另有研究表明,菌株的自凝聚能力對形成生物膜有重要影響,與腸道定植密切相關[20]。

圖4 KL22的自凝聚能力Fig.4 Auto-aggregation of KL22

2.5 KL22的降膽固醇能力分析

將KL22接種于含有10 mg/mL膽固醇的改良MRS培養基中,測定其膽固醇的降解率,結果見圖5。

圖5 KL22對膽固醇降解率Fig.5 The result of degradation rate of cholestrolo

由圖5可知,24、48 h作用時間均有一定的降膽固醇能力,24 h的降膽固醇能力較48 h要弱。活菌狀態的KL22作用48 h后的膽固醇降解率最高,達到52.94%,滅活狀態作用48 h和滅火狀態作用24 h次之,膽固醇降解率分別為35.79%和27.96%,活菌狀態作用24 h最低,為16.93%。在目前的文獻報道中,膽固醇降解率達到40%以上的菌株寥寥無幾,由此得出KL22的膽固醇降解能力較強[22]。對于益生菌降膽固醇機理,近年來各學者進行了較多的研究,主要集中在吸收同化理論、共沉淀理論和其他理論[12],實驗菌株KL22對膽固醇的降解能力基于何種機制還有待進一步研究。

2.6 KL22誘導Caco-2細胞中基因在mRNA水平上的表達變化

細胞因子是一類可參與免疫應答、調節炎癥反應的蛋白質或多肽[23]。本實驗以Caco-2細胞為模型,并通過2-ΔΔCt法分析KL22作用于Caco-2細胞后免疫相關因子的表達量變化,結果見表2。

由表2可知,當菌懸液濃度為108CFU/mL時,上調了IL-8和TNF-α基因的表達水平,然而下調了BD-2基因的表達水平。另外,當菌懸液濃度為106CFU/mL時,會下調IL-8、TNF-α和BD-2在Caco-2細胞中的表達。其中,IL-8是一種趨化因子,TNF-α是一種促炎性細胞因子,在參與和調節炎癥反應、維持機體正常免疫生理狀態等方面發揮著重要的作用;BD-2是一種具有廣譜抗菌的多肽,被激活后發揮抗菌防御作用,使機體的保護性因子,在免疫性疾病組織中高表達,而在非炎性機體中低表達[24]。以上結果表明,菌株KL22可調節機體免疫系統或免疫細胞表達不同類型的細胞因子,進而提高宿主免疫力[23],且兩種菌液濃度均未上調BD-2的表達,說明KL22不會引起Caco-2細胞的抗菌排斥反應,可見KL22在抵抗炎癥和抵抗腫瘤細胞生長等方面具有一定的潛力。

表2 KL22誘導Caco-2細胞中IL-8、TNF-α和BD-2基因的表達Table 2 KL22 induced gene expressions of IL-8,TNF-α and BD-2

2.7 抗生素敏感性

抗生素敏感性是分析菌株在應用中安全使用的重要特征。因此,采用改良K-B法對KL22進行了抗生素敏感試驗,結果以美國CLSI文件的最新版本執行標準進行判定,如表3所示。

表3 抗生素敏感試驗結果Table 3 The result of antibiotic susceptibility test of KL22

從表3可以看出,在對抗生素的藥敏性試驗中,菌株KL22對25種抗生素均敏感(S);對四環素表現為中度敏感(M);對環丙沙星、萬古霉素、復方新諾明和苯唑西林表現出抗性(R)?？梢?KL22的安全風險較低?？股厥且环N生理活性物質,其抗菌活性主要表現在三種現象:抗菌、殺菌和溶解[25]。對細菌的殺菌作用表現在對細菌細胞壁的強氧化作用以及核酸和細胞內蛋白質的破壞。益生菌的使用要避免耐藥基因的傳播,如果抗性基因不能進行轉移,菌株即可引進市場[26]。此外,針對上述四種抗生素抗性現象的發生機制,仍需要進一步研究分析,可能有助于益生菌在抗生素使用方面的應用。

3 結論

本研究從分離自波蘭開菲爾粒的L.kefiriKL22入手,通過比濁法和跟蹤pH確定其生長曲線和產酸曲線;通過菌株的益生特性研究,表明KL22具有較好的疏水性和自聚合能力;通過體外降膽固醇實驗,表明KL22的膽固醇降解率在16.93%～52.94%。此外,KL22能夠通過調整細胞因子的表達量,進而在機體的免疫炎癥反應和抗腫瘤過程中發揮作用;在抗生素敏感方面,KL22對四環素表現為中度敏感(M),對環丙沙星、萬古霉素、復方新諾明和苯唑西林表現出抗性(R),對其它25種抗生素均表現出敏感(S)。綜上所述,本實驗的受試菌株KL22具有較好的疏水性、抑制有害菌粘附作用、抗氧化性、降膽固醇能力,并可調節細胞因子表達量,具有作為益生菌的良好潛質和應用前景。

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