PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長狀況的影響

賈冰冰 葉 夢 霍麗蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在神經(jīng)退行性疾病中流行趨勢位居第二，表現(xiàn)為肌肉僵直、運動遲緩、肌強直和靜止性震顫[1，2]。PD的特征在于紋狀體區(qū)黑質致密部的多巴胺能神經(jīng)元進行性壞死和缺失，雖然通過使用左旋多巴、多巴胺脫羧酶抑制劑、多巴胺激動劑和深部腦刺激等方法，臨床癥狀可以得到一定改善，但此類方法未能阻止神經(jīng)元變性死亡[3～5]。PCBP1含有3個KH同源域。在哺乳動物中，PCBP1可通過KH同源域識別并結合含多聚胞嘧啶的DNA和RNA序列。PCBP1在細胞質和細胞核中均可表達，但主要定位于細胞核。PCBP1基因可被翻譯為具有多功能、多聚胞嘧啶特性的核酸結合蛋白。PCBP1通過與多聚胞嘧啶結合的特性在基因表達中起著重要作用，如mRNA穩(wěn)定、RNA剪切、特殊基因的轉錄調控等[6，7]。本研究通過將pEGFP/N-PCBP1重組質粒轉染HA細胞，再加入神經(jīng)毒素6-OHDA后，探討PCBP1基因的過表達對人星形膠質細胞生長狀況的影響。

材料與方法

1.材料和試劑：人星形膠質細胞由首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所惠贈。各種細胞培養(yǎng)基購自美國Gibicol公司；臺盼藍購自北京索萊寶生物科技有限公司。CCK-8試劑盒、卡那霉素、限制性內切酶EcoRⅠ、感受態(tài)細胞制備試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生物工程有限公司。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。pEGFP/N-PCBP1重組質粒為筆者研究室保存。

2.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1擴增與鑒定：以含PCBP1的重組質粒為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)對目的基因PCBP1進行擴增，上游引物：5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′，下游引物:5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAG-CTGCACC-3′，目的片段包含PCBP1的起始子及終止子并含有EcoRⅠ酶切位點。將PCR擴增片段用EcoR Ⅰ酶切，進一步純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳；將超低溫冰箱中取出的感受態(tài)細胞置冰上融化，每100μl感受態(tài)細胞中加入100pg～10ng待轉化質粒，輕柔混勻，于冰上靜置30min，將離心管置42℃水浴鍋中孵育60s，取出后立即冰上放置2～3min，取適量菌液涂布至卡那霉素抗性的LB平板中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。孵育后挑取單個細菌菌落，于含抗生素的液體培養(yǎng)基中，放置在37℃水平搖床上進行擴增12～16h。收集菌液進行質粒提取，將提取質粒以EcoRⅠ酶切，純化后進行DNA測序，明確重組質粒的準確性。

3.HA的培養(yǎng)和轉染：人源星形膠質細胞系HA細胞用含10%FBS,1%青霉素-鏈霉素混合的培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基。細胞達到90%融合時，1%PBS洗滌兩遍，用0.125%的胰酶消化，傳代。轉染前1天，取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)PBS洗滌和胰酶消化后，按照104個/毫升濃度接種到6孔板中，在細胞鋪滿皿底時，將細胞上清液棄掉，更換為不含雙抗的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8h后，用LipofectamineTM2000轉染試劑對HA細胞進行轉染，取3μg的pEGFP/N1-PCBP1或pEGFP/N1質粒與250ml的opti-MEM混勻，且將10μl的脂質體與250ml的opti-MEM混勻，室溫孵育5min后分別將兩種質粒與脂質體進行混勻，室溫靜置20min,再將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)基中，邊滴加邊晃動培養(yǎng)皿。轉染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP-N1可發(fā)綠色熒光。

4.CCK-8法檢測PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長狀況的影響：將處于對數(shù)生長期的細胞按5×103個接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl培養(yǎng)基。將細胞分為pEGFP/N1-PCBP1(實驗組)和pEGFP/N1(對照組)，按照上述方法進行轉染。轉染24h時分別將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組中，每個樣本重復5次。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加10μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育3h后，應用酶聯(lián)免疫儀檢測于波長450nm處測定吸光度(A)值。

5.細胞計數(shù)法檢測：將對數(shù)生長期細胞按2×104個接種到12孔培養(yǎng)板中，每孔1.5ml培養(yǎng)基，分別對實驗組和對照組細胞進行轉染，轉染24h時將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組中，設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度。同時，將各組細胞經(jīng)胰酶消化后，制備細胞懸液，經(jīng)臺盼藍染色后，進行細胞計數(shù)。

結 果

1.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1的鑒定：重組質粒pEGFP/N1-PCBP1經(jīng)酶切，純化后進行DNA測序及瓊脂糖凝膠電泳，PCBP1基因插入位點及所編碼序列正確(圖1)。

圖1 DNA測序分析重組質粒pEGFP/N1-PCBP1箭頭所指為PCBP1基因插入質粒的相應位點

2.質粒轉染HA細胞:用對照質粒 pEGFP/N1和重組pEGFP/N1-PCBP1分別對HA細胞進行轉染，轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1發(fā)出綠色熒光(圖2)。

圖2 倒置熒光顯微鏡分析質粒在BV-2細胞中的表達(×20)A.對空載質粒pEGFP/N1在HA細胞中的表達；B.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1在HA細胞中的表達

3.PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長變化的影響：將HA細胞種植于12孔板中，轉染后24h，將不同濃度的6-OHDA滴加到實驗組和對照組細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)3天開始進行細胞計數(shù)和CCK-8法檢測細胞A值。細胞計數(shù)法和CCK-8法顯示,5、10μmol/L 6-OHDA作用下，實驗組細胞較對照組增殖加速，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。20、30μmol/L 6-OHDA作用下，實驗組和對照組的細胞增殖情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖3 細胞計數(shù)法檢測PCBP1轉染后對HA細胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

4.HA細胞轉染PCBP1后的生長現(xiàn)象:如圖5所示，在5、10μmol/L的6-OHDA作用下，轉染PCBP1的HA細胞明顯達到80%的匯片率；而20、30μmol/L的6-OHDA作用下，轉染PCBP1的HA細胞與對照組細胞的生長狀況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4 CCK-8法檢測PCBP1轉染后對HA細胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

圖5 PCBP1轉染后促進細胞生長現(xiàn)象(×20)A.5μmol/L 6-OHDA；B.10μmol/L 6-OHDA；C.20μmol/L 6-OHDA；D.30μmol/L 6-OHDA。1.對照組細胞生長狀況；2.實驗組細胞生長狀況

討 論

PCBP1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用逐漸成為目前研究的熱點[8]。PCBP1主要通過與多聚胞嘧啶的結合發(fā)揮重要生物學作用[9]。PCBP1含有兩種核定位信號序列(nuclear localization signal,NLS)，NLS可調節(jié)蛋白由細胞質到細胞核的轉運。PCBP1可作為特殊基因的轉錄調控子，參與環(huán)境信號轉錄應答的調節(jié)。PCBP1主要參與pre-mRNA的編輯和選擇性剪切、mRNA出核和翻譯調控等[10,11]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種最為嚴重的核纖層疾病——早老綜合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)，與PCBP1可能密切相關，此研究證明在早老綜合征細胞中可見Lamin A聚集在核內膜，PCBP1可與Lamin A/C結合又可作為Progerin的相互作用伙伴。PCBP1用于調節(jié)早老綜合征細胞中的各種RNAs和蛋白質的表達仍有待進一步研究。由此看來，PCBP1可能與細胞的復制分化過程有關，此功能的干預可關系到早老綜合征的病理進程[12]。小熱休克蛋白(the small heat shock protein,HSPB1)突變可導致嚴重的周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13,14]。Geuens等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PCBP1可與HSPB1-P182L突變蛋白特異性結合，而導致其翻譯抑制活性的降低。通過RNA免疫沉淀法對小鼠大腦RNA測序顯示PCBP1 mRNA為HSPB1-P182L突變蛋白作用靶點，且這些靶點由大量的 3′-和5′-UTRs以及豐富的CTCCTCCTCCTCC共有序列組成。因此，在神經(jīng)退行性疾病中，HSPB1可與PCBP1相互作用降低翻譯抑制性。

本研究將PCBP1重組質粒轉染SH-SY5Y細胞，通過熒光顯微鏡觀察，PCBP1主要在神經(jīng)元細胞系SH-SY5Y細胞的胞質和核膜中廣泛表達，且細胞生長速度明顯增加[16]。在本研究中，重點關注PCBP1對神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質細胞的作用，在神經(jīng)毒素6-OHDA作用下，PCBP1對星形膠質細胞的生長情況有何影響。實驗中通過CCK-8法和細胞計數(shù)法證明，與對照組比較，在低濃度的6-OHDA作用下，轉染PCBP1重組基因的HA細胞生長明顯加劇。推測可能是由于6-OHDA進入細胞內后激起氧化活性物質(ROS)、超氧化物(H2O2)等產(chǎn)生，進而導致細胞不可逆性死亡[17]。然而，神經(jīng)細胞壞死的嚴重程度與6-OHDA的濃度有明顯關系[18，19]。本研究初步證明了PCBP1對神經(jīng)毒素有一定的抗性作用，且在星形膠質細胞生長和發(fā)育中起重要作用。