TAZ基因在喉癌組織中的表達規律及其對Hep2細胞增殖的影響

程秀琴 艾力根·阿不都熱依木 唐 亮

喉鱗狀細胞癌 (LSCC)是頭頸部常見腫瘤之一，在我國東北地區高發，且發生率逐年上升，但病因不明[1，2]。病因學上統計結果顯示其發生可能與吸煙、飲酒、人類乳頭瘤病毒感染、喉咽反流及胃食管反流疾病等諸多因素有關，另外還與ras、c-myc、EFGR、PRAD、Int-2等癌基因和p53、p16、FHIT等抑癌基因有關[3～5]。目前其主要治療手段為手術切除配合放射治療、化學治療，隨著治療手段的進步，喉癌患者術后生活質量不斷改善，但近30年來喉癌術后患者5年生存率仍沒有明顯提高[6]。因而尋找與喉癌發生有關的新基因，對了解喉癌發生、發展的分子機制及臨床干預具有重要意義。

Hippo信號通路是一個涵蓋30多個組件復雜的信號網絡，越來越多的調節因子逐漸被鑒定，最核心的部分包括一系列級聯激酶和轉錄共活化因子。以哺乳動物為例，Hippo核心成員包括Mst、Lats，相關輔因子WW45和Mob等激酶及轉錄共活化因子YAP/TAZ等。該通路上游的核心成員主要通過逐級磷酸化抑制下游轉錄共活化因子YAP/TAZ，減少其核內轉錄復合物活性，進而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和控制細胞數目[7,8]。TAZ是Hippo信號通路主要的下游效應因子之一，影響增殖分化等相關基因的表達，屬于致癌基因，據報道其在多種人類癌癥中表達異常。但目前并未有TAZ在人喉癌組織中的相關報道。

本研究首次檢測了32例喉癌組織及癌旁組織中TAZ的表達，并證實了TAZ在喉癌Hep2細胞中促進細胞增殖的作用，旨在發現與喉癌發生、發展有關的新基因。

材料與方法

1.化學試劑:脂質體轉染試劑購于美國Invitrogen公司；MTT粉購自美國Amresco公司；實時PCR引物及過表達載體均購自廣州銳博公司；鼠抗人TAZ、LATS1、E-cadherin、Vimentin、GAPDH、β-actin單克隆抗體購自美國CST公司。

2.細胞株及組織：Hep2細胞為人喉癌細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。32例原發性喉癌組織標本來自2010年1月～2017年8月期間筆者醫院手術切除的喉癌根治術標本，所有患者術前均未接受放射治療、化學治療處理，經病理證實為喉鱗狀細胞癌。患者年齡為43～75歲，取癌和癌旁<1cm范圍內正常組織于-80℃凍存。

3.免疫組織化學:將收集的患者組織樣本，用4%PFA固定后石蠟包埋切片，濕紙巾鋪于載玻片盒底部做成加濕盒備用：切片常規脫蠟至水，hydrogen peroxide block中孵育10min將以降低非特異性背景染色；緩沖液清洗后滴加一抗工作液37℃孵育2h；洗去一抗滴加一抗增強子(primary antibody enhancer)室溫下孵育20min；緩沖液清洗后滴加酶標二抗室溫下孵育30min；洗去二抗，向1ml DAB+基質(plus substrate)中滴加2滴 DAB+色原(plus chromogen)混勻后滴加到切片上，孵育10min；自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。

4.MTT法檢測細胞增殖活性:細胞用MTT比色測定細胞增殖活性：將細胞接種于12孔板，細胞104個/孔，24h后吸去上清液，分別轉染pcDNA3.1-TAZ質粒及對應空載48h。分別在1、2、3天收集培養好的TAZ過表達細胞及對應空載細胞經胰酶消化后制成細胞懸液接種于96孔板中，濃度為1×105/ml，每孔100μl，孵育24h后換液，每孔加入10μl的MTT，濃度為5mg/ml，4h后，通過酶標儀檢測各孔495nm波長的吸光度(A)值。按以下公式計算細胞增殖率：增殖率(%)=(實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。

5.細胞集落形成實驗:將培養好的細胞接種于12孔板，細胞104個/孔，24h后吸去上清液，分別轉染pcDNA3.1-TAZ質粒及對應空載48h。將培養好的TAZ過表達細胞及對應空載細胞經胰酶消化后制成細胞懸液接種于平板中，在每60mm培養皿中置入1000個細胞，每隔3天更換培養基。7天后，在顯微鏡下觀察細胞集落形成情況并拍照。

6.實時PCR檢測TAZ及EMT相關基因的 mRNA水平：將收集的患者組織樣本用TRIZOL法提取總RNA，用Thermo公司的Nanodrop 2000分光光度計測定RNA的濃度和純度，點樣量為1μl，通過儀器分析及計算機直接讀出濃度(ng/μl)，并根據A260/A280比值判斷純度。然后按照反轉錄試劑盒說明書方法進行反轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板，按照實時PCR試劑盒說明書方法檢測樣本中TAZ的轉錄水平。引物序列詳見表1，每個樣本3個復孔，按兩步法PCR擴增，條件為：步驟1:95℃ 30s；步驟2:95℃ 5s，60℃ 30s(40個循環)；步驟3: Melt Curve(美國Bio-Rad公司，CFX96)。反應結束后確認實時PCR的擴增曲線及溶解曲線是否滿足要求，儀器軟件中自動輸出Ct值，計算相對表達量采用2-△△Ct方法，按照下列公式計算：△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(轉染YAP1細胞)-ΔCt(轉染空載細胞)。

7.Western blot法檢測TAZ、Hippo及EMT相關基因的蛋白表達：將培養好的細胞接種于6孔板，細胞105個/孔，24h后吸去上清液，分別轉染pcDNA3.1-TAZ(LATS1)質粒及對應空載，48h后收集細胞提取蛋白。細胞用改良的RIPA緩沖液裂解(美國Sigma-Aldrich公司)，蛋白質含量用Bradford reagent(美國Thermo Scientific公司)測量。所提取蛋白(50μg)在變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，然后轉移到PVDF膜(微孔)，以5%的脫脂牛奶封閉(印度HiMedia公司)。然后使用增強化學發光(ECL)暗室顯影，凝膠成像儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)掃描紀錄，以β-actin作為內參，進行分析比較。

表1 RT-PCR引物序列

結 果

1.TAZ在喉癌組織中高表達:收集32例患者喉癌組織及癌旁組織樣本進行免疫組織化學染色，結果顯示喉癌組織中TAZ的表達明顯增加(圖1A)。分別提取32例患者喉癌組織及起癌旁組織樣本總RNA并反轉錄得cDNA，經實時PCR分析發現癌組織中TAZ轉錄顯著上調(圖1B)。

圖1 TAZ在喉癌組織和癌旁組織的表達規律A.免疫組化結果；B.32例喉癌組織臨床樣本實時PCR結果

2.TAZ對人喉癌細胞系Hep2細胞增殖的影響:為進一步探知TAZ對喉癌細胞的作用，筆者將TAZ基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉染到喉癌Hep2細胞中，Western blot法檢測轉染效果，結果如圖2A所示，表明轉染成功。過表達TAZ細胞用MTT比色測定細胞存活率，結果顯示TAZ過表達后Hep2細胞活力增加(圖2B)，同時細胞集落形成實驗也證實TAZ過表達后Hep2細胞增殖情況顯著增加(圖2C)。

圖2 TAZ促進Hep2細胞增殖A.Hep2細胞TAZ過表達檢測；B、C.MTT分析及菌落形成實驗表明，過表達TAZ促進Hep2細胞增殖；與Hep2-vector組比較，*P<0.05

3.TAZ對人喉癌細胞系Hep2細胞EMT過程的影響:為繼續探究TAZ促進人喉癌細胞增殖的原因，筆者將TAZ基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉染到喉癌Hep2細胞中，檢測過表達TAZ后細胞EMT過程中相關指標的變化。實時PCR結果顯示，Twsit、Slug、Vimentin等間質細胞特異性基因表達顯著上調，而E-cadherin等上皮細胞特異性基因表達顯著下降(圖3A)，表明過表達TAZ后，喉癌細胞系Hep2出現上皮間質樣轉變，Western blot法檢測結果得到一致的結論(圖3B)。

圖3 TAZ激活Hep2細胞EMT過程A.RT-PCR分析;B.Western blot法檢測；與對照組比較，**P<0.05

4.TAZ影響Hep2細胞EMT過程與Hippo信號通路的關系:為進一步探討TAZ促進Hep2細胞EMT過程是否與Hippo信號通路有關，筆者將Hippo信號通路關鍵基因LATS1基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉染到喉癌Hep2-TAZ細胞中，檢測過表達LATS1激活Hippo通路后細胞EMT過程中相關指標的變化。Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，過表達LATS1抑制TAZ表達，同時Vimentin等間質細胞特異性基因表達顯著降低，而E-cadherin等上皮細胞特異性基因表達顯著增加(圖4A)，表明過表達LATS1后，喉癌細胞系Hep2-TAZ上皮間質樣轉化受到抑制，實時PCR結果得到一致的結論(圖4B)。

圖4 TAZ激活Hep2細胞EMT過程依賴Hippo信號A.實時PCR分析；B.Western blot法檢測；與對照組比較，*P<0.05

討 論

TAZ，一個由WWTR1基因編碼帶PDZ結合基序的共轉錄激活因子，因與14-3-3蛋白結合而被發現，屬于Hippo通路的另一個效應基因，能與TEAD、RUNX2、Glis3等轉錄因子結合發揮不同功能，如細胞增殖，遷移及分化等，其功能異常導致細胞過度增殖，甚至誘發腫瘤[9，10]。此外，其亦可響應許多胞外或胞內的信號，包括細胞密度、機械壓力、能量狀態、缺氧等[11]。據報道，TAZ 作為一個致癌基因在多種人類癌癥中表達并扮演重要角色，如肝內膽管癌，乳腺癌，橫紋肌肉瘤等，調控著癌細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、入侵、間充質轉化(EMT)及多能性[12～15]。但TAZ基因與喉癌的相關性及其在喉癌中的作用國內外尚未見報道。

本研究中筆者發現較癌旁組織，喉癌組織中TAZ基因顯著高表達(圖1)。免疫組化結果顯示，喉癌組織中TAZ細胞核內定位明顯增加，提示喉癌組織中過表達的TAZ可能通過入核與相關轉錄因子結合，調節下游增殖等相關基因的表達進而調控細胞增殖等，從而參與喉癌的發生、發展。本研究構建了重組真核表達載體pcDNA3.1-TAZ，并轉染喉癌Hep2細胞，使TAZ蛋白在Hep2細胞中表達增加，后續的細胞增殖能力分析顯示，TAZ基因表達增加能明顯增加Hep2細胞的增殖能力(圖2A)。此與筆者在喉癌組織中的表達檢測結果相符，證實TAZ基因能發揮致癌基因的作用，誘導Hep2腫瘤細胞增殖及喉癌的發展形成。進一步研究其促進喉癌細胞增殖過程中發現，TAZ促進喉癌細胞系Hep2細胞的增殖可能是通過促進EMT過程實現，實時PCR及Western blot法檢測結果顯示Twsit、Slug、Vimentin等間質細胞特異性基因表達顯著上調，而E-cadherin等上皮細胞特異性基因表達顯著下降，表明過表達TAZ后，喉癌細胞系Hep2出現上皮間質樣轉變(圖3)。同時在該TAZ活化細胞系中轉染LATS1表達載體以激活Hippo信號通路，并檢測EMT過程相關基因的變化，實時PCR及Western blot法檢測結果顯示過表達LATS1后，喉癌細胞系Hep2-TAZ上皮間質樣轉變受到抑制，證明TAZ促進喉癌細胞Hep2增殖的過程是依賴Hippo信號通路的(圖4)。

作為 Hippo 通路的一個效應基因，TAZ與TEAD、RUNX2、MyoD等轉錄因子結合發揮功能，并受 Hippo 依賴或非依賴的方式調控[16]。TAZ與MyoD結合促進肌細胞分化[17]。在非酒精性脂肪肝病中，TAZ肝細胞表達增加促進炎癥、細胞死亡及纖維化[18，19]。除調控細胞組織發育外，TAZ在多種人類癌癥中也扮演非常重要的角色，調控著癌細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、入侵、間充質轉化(EMT)及多能性，在多種人類癌癥如肝內膽管癌，乳腺癌受到重視[20]。筆者的研究結果顯示，TAZ在喉癌組織中高表達并以Hippo依賴的方式促進細胞EMT轉換過程，此結論為人類TAZ基因在癌癥中的重要性和廣泛性予以補充，同時為喉癌的發生、發展提供新的理論基礎。

綜上所述，喉癌的發生、發展與TAZ高表達相關，且TAZ高表達能促進Hep2細胞增殖，對進一步了解喉癌發生、發展的分子機制及臨床干預具有重要意義。