Nrf2、HO-1在經典型霍奇金淋巴瘤的表達與其臨床特征的關系

薛 麗 伊雪梅 張 婧 黨雅梅 趙鳳輝 李紅玲

經典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin′s lymphoma, cHL) 是一種起源于淋巴造血系統的惡性腫瘤，占所有霍奇金淋巴瘤的95%，好發于青年及老年人[1]。cHL患者的預后較好，70%～80%的患者經過規范化治療可達到5年的生存率，但仍有5%～10%的患者會出現耐藥，10%～30%的患者會出現緩解后復發，從而表現為復發難治和較差的預后[2, 3]。氧化應激是由活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生與細胞抗氧化能力之間失衡而導致機體處于的病理狀態。研究表明，氧化應激與腫瘤的發生、發展具有一定的相關性[4]。相對高濃度的ROS的細胞內積累可誘導DNA的氧化損傷，這可能參與腫瘤的發生、發展，與氧化應激相關的凋亡信號途徑的有關基因很可能會對腫瘤的治療提供參考。核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)屬于 Cap-n-collar (CNC)家族，是具有堿性亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，廣泛存在于機體各個器官，是細胞對抗氧化應激反應的主控調節因子[5]。正常情況下，Nrf2的活化可預防心血管疾病、肺纖維化、糖尿病、衰老、神經退行性疾病、腫瘤等的發生[6]。血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一種誘導性微粒體催化酶，具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用[7]。然而，許多研究表明，Nrf2和HO-1在許多人類腫瘤中異常高表達，且其高表達與腫瘤細胞增殖、侵襲轉移、化學抗性等生物學行為有關[8]。本研究通過SP免疫組化法檢測Nrf2和HO-1在cHL組織中的表達，初步探討Nrf2和HO-1在cHL發生、發展中可能發揮的作用。

材料與方法

1.臨床資料:收集2012年1月～2017年12月由筆者醫院確診的42例初發cHL患者的資料和標本，其中男性27例，女性15例；患者年齡5～78歲，中位年齡39.5歲。所有患者經病理及免疫組化確診為cHL。其診斷及分類標準依據WHO 2016年版《淋巴造血系統腫瘤分類標準》，結節硬化性19例，混合型16例，淋巴細胞豐富性7例。所有患者臨床資料完整。并收集同期診治的23例淋巴結反應增生患者作為對照組，患者年齡9～67歲，中位年齡42歲。本研究經筆者醫院倫理學委員會批準，患者知情同意。

2.免疫組化：兔抗人Nrf2多克隆抗體(rabbit anti-Nrf2 antibody，ab137550)和兔抗人HO-1多克隆抗體(rabbit anti-HO-1 antibody，ab13243)購自英國Abcam 公司；免疫組化SP試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。所有標本均經10%甲醛緩沖液固定，常規石蠟包埋，制作4μm切片，行免疫組化染色。SP免疫組化法嚴格按試劑盒說明書進行操作。Nrf2和HO-1工作濃度均為1∶100。所有切片采用檸檬酸緩沖液煮沸進行修復抗原，以 PBS 代替一抗作為陰性對照。

3.結果判定：采用雙評分半定量法進行評分，在每張載玻片上隨機選取5個視野，并且在每個高倍視野(×400)下計數100個細胞。根據染色強度和陽性細胞的百分比2種計分方式進行綜合評分。結果判定由筆者醫院兩位資深病理學專家進行雙盲法評估。Nrf2 和HO-1的陽性表達均主要見于細胞核內，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。依據陽性細胞百分比：≤5%計為0分，6%～25% 計為1分，26%～50% 計為2分，≥51% 計為3分。依據染色強度：無染色計為0分，弱染色計為1分，中等染色計為2分，強染色計為3分。將兩個分數相乘即染色指數得最終診斷標準: 0 分為(-)，1～9分為陽性，其中1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，7～9分為強陽性(+++)。本實驗以+～+++為陽性表達。

4.統計學方法：應用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行統計處理。組間比較采用χ2檢驗[n≥40，且所有理論頻數(T)≥5]或連續校正χ2檢驗(n≥40，但有1≤T<5)。Nrf2和HO-1表達水平的相關性采用Spearman相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.Nrf2在cHL及淋巴結反應增生組織中的的表達:Nrf2的陽性表達主要見于細胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。Nrf2在cHL和淋巴結反應增生組織中的陽性表達分別為 42.9%和13.0%，差異有統計學意義(P<0.05，表1，圖1) 。

表1 Nrf2、HO-1在cHL和淋巴結反應增生組織中的表達 [n(%)]

圖1 Nrf2在cHL組織中的表達(SP，×400)A.Nrf2表達呈陰性(-);B.Nrf2表達呈弱陽性(+);C.Nrf2表達呈中等陽性(++);D.Nrf2表達呈強陽性(+++)

2.HO-1在cHL及淋巴結反應增生組織中的的表達:HO-1的陽性表達主要見于細胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。HO-1在cHL和淋巴結反應增生組織中的陽性表達分別為 47.6%和17.4%，差異有統計學意義(P<0.05，表1，圖2)。

圖2 HO-1在cHL組織中的表達(SP,×400)A.HO-1表達呈陰性(-);B.HO-1表達呈弱陽性(+);C.HO-1表達呈中等陽性(++);D.HO-1表達呈強陽性(+++)

3.Nrf2、HO-1的表達與cHL臨床病理特征的關系:Nrf2、 HO-1在cHL組織中的表達均與患者性別，年齡，LDH，病理分型無關(P>0.05)，而與Ann Arbor stage臨床分期，B癥狀有關(P<0.05)。臨床分期 Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2、HO-1陽性表達(分別為61.5%和65.4%)高于Ⅰ～Ⅱ期患者(分別為12.5%和18.8%)；Nrf2、HO-1在有B癥狀患者中的陽性表達(分別為62.5%和75.0%)高于無B癥狀患者(分別為16.7%和11.1%),詳見表2。

表2 Nrf2、HO-1的表達與cHL臨床病理特征的關系 [n(%)]

4.Nrf2與HO-1在cHL組織中表達的相關性：在cHL組織中，Nrf2 與HO-1 蛋白的表達呈正相關 (r=0.619，P<0.05，表3)。

表3 Nrf2、HO-1在cHL中表達的相關性分析 (n)

討 論

Nrf2是調控細胞對抗異源性物質和氧化損傷的關鍵轉錄因子。Nrf2的活性主要由Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1)負性調節，生理狀態下，Nrf2 與Keap1偶聯并與胞質肌動蛋白結合被錨定在胞質，從而促進Nrf2被泛素蛋白酶體 (Cul3 E3) 降解，導致Nrf2的表達量維持在較低水平以維持基本轉錄。當機體處于氧化應激狀態時，Nrf2與Keap1解偶聯并轉移入核，與Maf蛋白結合成異二聚體后識別并與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合，從而激活多種抗氧化基因和解毒基因的轉錄，包括HO-1，作為細胞對氧化損傷的一種保護性反應[9]。因此，傳統上Nrf2一直被認為是介導細胞防御反應的重要因子，協助抵抗氧化應激損傷，保護細胞免受化學物質的損害，成為化學預防研究領域的熱點。然而，越來越多的研究表明，Nrf2不僅可以保護正常細胞轉化為腫瘤細胞，而且還可以保護腫瘤細胞免受氧化應激以及放化療損傷，從而有助于腫瘤細胞生長[10]。文獻報道，Nrf2在多種人類腫瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌等中表達均上調，它的持續異常活化與腫瘤進展，侵襲轉移以及放療、化療抗性有關[11～13]。迄今為止，Nrf2在cHL組織中的表達及意義尚未見文獻報道。

HO-1被認為是Nrf2下游細胞應答的主要效應物之一，它是血紅素代謝的限速酶，能將血紅素降解為膽紅素、一氧化碳(CO)和鐵離子(Fe2+)，三者均在維持細胞穩態中發揮著重要作用[14]。它是一種在多數哺乳動物組織中以低水平存在的應激蛋白，其表達由多種刺激誘導，包括缺氧、重金屬、內毒素、細胞因子、血紅素、一氧化氮及紫外線照射[15]。HO-1及其代謝產物在保護健康細胞及細胞應激的適應性反應中發揮關鍵作用，因其可通過抵抗ROS介導的致癌作用來預防它們轉化為惡性細胞[16]。然而，HO-1被發現在人類多種腫瘤中高表達并與生物學行為密切相關。Tsai等[17]發現HO-1高表達與非小細胞肺癌的侵襲轉移有關。Noh等[18]發現HO-1對乳腺癌的預后具有指導意義。Huang等[19]發現HO-1上調抑制了彌漫大B細胞淋巴瘤細胞凋亡。Mayerhofer等[20]發現在慢性粒細胞白血病中HO-1與伊馬替尼耐藥有關。Cerny-Reiterer等[21]發現HO-1是急性淋巴細胞白血病中必不可少的生存因子和潛在的新靶標。目前，HO-1在cHL組織中的臨床價值尚缺乏相關研究。

本研究通過免疫組化法檢測發現，Nrf2和HO-1在cHL組織中均呈高表達，且染色反應主要定位于細胞核內，這一結果與兩者在其他許多惡性腫瘤中的表達基本一致，這可能對cHL的臨床治療具有一定指導意義。此外，筆者還分析了Nrf2和HO-1表達與臨床病理特征間的關系，發現隨著cHL臨床分期越晚，Nrf2和HO-1的表達越高(Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期)；同時發現兩者在有B癥狀cHL患者中的表達高于無B癥狀者，目前有研究已明確表明B癥狀與霍奇金淋巴瘤的不良預后有關，這些結果表明Nrf2和HO-1的表達可能與cHL的進展有關。而且，筆者還發現Nrf2與HO-1在cHL組織中的表達呈正相關，這表明Nrf2/HO-1信號通路對cHL的發生、發展具有重要的生物學作用，Nrf2可能對 HO-1 的生成起到正向調節作用,兩者具有協同作用，其可能歸因于惡性轉化過程中細胞的應激反應和自我保護作用。然而，由于本研究未對以上患者進行隨訪，中位生存期未知，因此Nrf2和HO-1是否與cHL患者的不良預后有關有待深入研究。而且，本研究樣本量相對較小，具有一定的局限性，確切的分子機制需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，本研究通過探討Nrf2和HO-1在cHL中的表達，發現兩者在cHL的發生、發展中起著重要作用。通過Nrf2/HO-1通路抗腫瘤作用值得深入研究,如Nrf2和HO-1基因可能為藥物治療提供新途徑。總之，Nrf2/HO-1通路有望為腫瘤的分子治療提供新的臨床思路。