柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43表達的影響

范才波 程闊菊 彭 雷 羅 云

臨床和基礎研究已證實柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂，主要表現為改善胃腸運動功能，但具體的作用機制尚不明確[1,2]。縫隙連接是具有電信號轉導和物質交換功能的細胞連接方式之一，而縫隙連接蛋白是其最基本的結構和功能單位[3]。胃腸神經-cajal間質細胞(interstitial cells of cajal,ICC)-平滑肌細胞通過ICC形成完整的網絡結構，并成為胃腸運動的基本功能單元[4,5]。縫隙連接蛋白43(connexin43,CX43)是該網絡結構中最重要的縫隙連接蛋白，對胃腸運動的電信號轉導和調節起著重要作用，電信號的傳播會因為CX43的減少或缺失而受到抑制，從而影響胃腸道的舒縮運動[6]。本研究擬從胃竇肌層CX43的表達變化來探討柴胡疏肝散改善胃腸功能紊亂的作用及機制，從而為臨床應用提供部分科學的理論依據。

材料與方法

1.實驗動物:雄性健康SD大鼠(SPF級)，體重230±20g，由成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號為SCXK(川2008-24)。

2.主要設備與試劑:柴胡疏肝散各味藥材購自達州市中西醫結合醫院中藥房，均附鑒定證書和合格證書，利血平購自天津金耀藥業有限公司(批號：1501161)，轉錄子一期分離試劑(transcriptor first tripure isolation reagent)、LightCycler 480 SYBR Green I Master均購自瑞士Roche公司，一抗：CX43、β-actin(細胞信號轉導，Cell Signaling)，熒光二抗、DAPI購自谷歌生物公司,LightCycler480購自瑞士Roche公司，Odyssey掃描成像系統購自美國LI-COR公司，倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-SR)購自日本Nikon公司，透射電子顯微鏡(HT7700)購自日本日立公司，切片機(型號UC7)購自德國Leica公司，鉆石切片刀(Daitome,Ultra 45°)。

3.藥物制備：柴胡疏肝散[7]湯劑由陳皮、柴胡各120g，川芎、枳殼(麩炒)、芍藥各90g，甘草(炙)30g，香附90g組成。藥材經清洗后溫水1000ml浸泡1h，后煎煮30min，提取2次，再合并水煎液，冰箱中保存備用。

4.模型制備及分組:實驗分組:取雄性健康SD大鼠80只，采用隨機數字表法分成4組，即空白對照組(對照組)、胃腸功能紊亂模型組(模型組)、對照+藥物組、模型+藥物組，每組分別為20只。模型制備參考英振昊的方法，按照0.5mg/(kg·d)的劑量連續腹腔注射利血平14天；對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水[8]。給藥方法：藥物組按照每只大鼠30ml/(kg·d)的柴胡疏肝散湯劑劑量，分兩次早晚灌服大鼠，于造模同時進行，連續14天，對照組給予等量滅菌注射用水灌胃。

模型制備是否成功的判定方法：(1)胃竇組織免疫組化：胃竇組織于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，脫水封片，光學顯微鏡下觀察記錄。(2)胃生物電檢測：大鼠經戊巴比妥麻醉后仰臥位固定，劍突下腹部正中切口，在胃竇距離幽門0.5cm處的漿膜下安置電極，電極另一端連接BL-420F生物機能實驗系統，記錄在體慢波并計算其頻率、振幅、慢波頻率變異系數和慢波振幅變異系數。(3)胃排空實驗：禁食36h后給予營養半固體飲食3ml，30min后取胃，稱重計量為M1，剪開胃體，清除胃內容物，用濾紙吸干水分稱重為M2，計算胃殘留率：(M1-M2)/2×100%。

5.實時PCR 檢測：待胃運動功能檢測結束后，剝離胃竇黏膜，將肌層組織迅速放入經液氮預冷的無酶EP管(預先已放入研磨珠子)中，在研磨器中對組織進行充分粉粹研磨。研磨結束后，向EP管中加入1ml三純分離試劑(tripure isolation reagent)，然后按照其說明書提取RNA，接著按照第一主選DNA合成試劑盒《Transcriptor First Stand cDNA Synthsis Kit》說明書將RNA 反轉成cDNA，然后于LightCycler?480儀器上對CX43進行實時PCR擴增檢測，內參為β-actin。建立待測基因的標準曲線和待測樣品的Ct值，據此計算出 SQ 值(起始量)，再計算CX43基因的相對表達量：CX43基因的相對表達量=CX43基因的起始量/β-actin基因的起始量。實時PCR引物相關信息詳見表1。

表1 CX43、β-actin實時PCR引物相關信息

6.Western blot法檢測：胃竇肌層組織的粉粹研磨同上，組織研磨結束后每EP管加入1ml 預冷的RIPA 緩沖裂解液，置冰上用超聲裂解儀充分裂解組織，于4℃下12000×g離心30min，收集上清液即為細胞的總蛋白溶解液，對蛋白濃度定量后加入SDS/PAGE煮沸5min變性蛋白，將蛋白轉移至NC膜，后續加入CX43、β-actin(大鼠)一抗及相應的二抗。采用Odyssey 掃描成像系統(美國LI-COR公司)對蛋白進行定量分析。

7.免疫熒光檢測：剝離大鼠胃竇肌層，經丙酮固定→常規乙醇逐級脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→切片→脫蠟→抗原修復→畫圈自發熒光淬滅→血清封閉→加一抗→加二抗→DAPI復染細胞核→熒光淬滅劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

8.電鏡檢測：取大鼠胃竇肌層不超過1mm×1mm×1mm組織，迅速投入電鏡固定液4℃中固定2～4h，0.1mol/L PBS漂洗，再用1%的鋨酸室溫固定2h，0.1mol/L PBS漂洗，不同濃度的乙醇-丙酮梯度脫水，經丙酮滲透、樹脂聚合、60～80nm超薄切片，鈾鉛雙染色后置透射電鏡下觀察。

結 果

1.模型制備:造模結束后模型組大鼠胃竇組織病理學表現為無器質性病變(圖1)；胃運動功能表現為慢波頻率及振幅下降(生物電檢測,P<0.05)、胃排空減慢(胃殘留率增多,P<0.05,表2)，根據模型組大鼠的胃組織病理學及運動功能表現，可判定模型制作成功。

圖1 大鼠胃腸功能紊亂動物模型胃和結腸的組織病理學表現(HE染色，×200)A.對照組；B.對照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

表2 大鼠胃腸功能紊亂動物模型胃運動功能檢測

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達量的影響:模型組大鼠胃竇肌層CX43的mRNA表達量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對正常大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達量無影響(P>0.05)，但可顯著上調胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達量(P<0.05)，詳見圖2。

3.柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43蛋白表達的影響:模型組大鼠胃竇肌層CX43的蛋白表達量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對正常大鼠胃竇肌層CX43 的蛋白表達量無影響(P>0.05)；但可顯著上調胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 的蛋白表達量(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達的影響與對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

圖3 柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43蛋白表達的影響與對照組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

4.柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 免疫熒光的影響:熒光顯微鏡下觀察，正常大鼠(對照組)胃竇肌層內可見均勻的CX43陽性表達；對照+藥物組與對照組類似；模型組CX43陽性表達顯著減少；模型+藥物組中CX43陽性表達較模型組顯著增多,詳見圖4。

圖4 柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43免疫熒光的影響(×400)A.對照組；B.對照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

5.柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43透射電鏡的影響：透射電鏡下觀察，正常大鼠(對照組)胃竇肌層內腸神經-ICCs-平滑肌網絡中腸神經與ICCs、ICCs相互之間、ICCs與平滑肌細胞以及平滑肌細胞相互之間存在完整的縫隙連接；對照+藥物組與對照組類似；模型組胃竇肌層內腸神經-ICCs-平滑肌網絡結構存在較大縫隙，較少發現有縫隙連接；模型+藥物組腸神經-ICCs-平滑肌網絡結構之間的連接基本保持完整,詳見圖5。

圖5 柴胡疏肝散對胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 透射電鏡的影響(5μm)A.對照組；B.對照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

討 論

胃腸功能紊亂是臨床上常見的非器質性功能性胃腸道疾病，以胃腸道運動功能障礙為主，臨床上表現為無器質性病變的腹痛、腹瀉、便秘等消化系統癥狀，發生率約為40%，約占胃腸道疾病的40%～60%，并呈逐年上升的趨勢[9，10]。其發病機制復雜，臨床上缺乏有效的化學藥物。臨床和基礎研究顯示柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂癥狀，但其具體的作用機制尚不明確[2,11]。隨著我國傳統醫學在全球范圍逐步得到認同，更多的國外研究者要求我國的傳統醫學能提供現代的科學理論依據。

正常的胃腸運動功能源于正常的胃腸蠕動，而正常的胃腸蠕動依賴于規律的慢波電位，研究證實腸肌間神經叢ICC (myentericICC,ICC-MY)是胃腸道內慢波電位的起博者，以突觸小體的方式將慢波電位傳遞給與肌內 ICC(intramuscular ICC，ICC-IM)和深肌層叢ICC(deep muscular plexus ICC,ICC-DMP)[12]。ICC-IM、ICC-DMP以縫隙連接的方式將慢波電位傳遞給平滑肌細胞，最終由平滑肌細胞執行胃腸道的舒縮功能[13]。ICC同樣以突出小體的形式與胃腸道自主神經和腸神經系統相連，將其興奮性或抑制性信號傳遞給平滑肌，從而起到調節胃腸道平滑肌收縮的作用[14]。因此，胃腸神經-ICC-平滑肌細胞通過ICC形成完整的網絡結構，并成為胃腸運動的基本功能單元。

縫隙連接蛋白43(connexin43,CX43)是ICC與平滑肌細胞及平滑肌與平滑肌細胞間最重要的縫隙連接蛋白，因此對胃腸運動的電信號轉導和平滑肌細胞的收縮起著重要作用[15]。電信號的轉導會因為CX43的減少或缺失而受到抑制，從而影響胃腸道的舒縮運動。如張國山[16]報道在功能性消化不良的大鼠模型中，模型大鼠胃腸道內的CX43表達顯著減少。吳全霞等[17]研究證實在糖尿病胃輕癱的大鼠模型中，胃竇肌層中的CX43表達顯著減少或缺失，證實在胃腸運動功能障礙中，胃腸道內CX43的表達量會減少或缺失，也可以從另一方面說明可能正是由于CX43的減少或缺失導致慢波電位不能順利地從ICC-IM、ICC-DMP傳播到平滑肌細胞以及在平滑肌細胞間的傳播，進而導致胃腸道的舒縮障礙。因此，通過上調胃腸道肌層內CX43的表達而調解慢波電位在胃腸道平滑肌細胞間的傳播，將有效的治療由胃腸道舒縮障礙導致的胃腸功能紊亂。

本研究利用腹腔注射利血平成功制備胃腸功能紊亂大鼠模型，胃運動功能表現為慢波頻率及振幅下降、胃排空減慢，利用實時PCR、Western blot、組織免疫熒光技術顯示在模型組大鼠的胃竇肌層中CX43的表達顯著減少，同時透射電鏡觀察到ICC與平滑肌細胞以及平滑肌與平滑肌細胞間的縫隙連接顯著減少，細胞間的間隙顯著變大，再次證明了在胃腸運動功能障礙中，會伴隨著CX43的減少或缺失。應用柴胡疏肝散干預后，胃竇肌層CX43表達顯著增多，ICC與平滑肌細胞以及平滑肌與平滑肌細胞間的縫隙連接增多，細胞間的間隙顯著變小，整體動物實驗表現為胃運動功能得到顯著改善，表明柴胡疏肝散能通過CX43的表達增加ICC與平滑肌細胞以及平滑肌與平滑肌細胞間的縫隙連接，調解慢波電位從ICC-IM、ICC-DMP到平滑肌細胞以及在平滑肌細胞間的傳播，從而改善胃腸蠕動。

綜上所述，柴胡疏肝散可通過上調胃竇肌層內CX43的表達而促進慢波電位的傳播，從而改善胃腸功能紊亂，但其具體調解機制包括對胃腸激素等的影響等尚需進一步研究。