HNF1A、HNF1B、C/EBPA和ZHX2基因多態(tài)性與血清AFP水平相關(guān)性研究

李雪君 邵冬華 何美琳 梁國(guó)威

甲胎蛋白(AFP)是目前原發(fā)性肝癌廣泛使用的腫瘤標(biāo)志物[1]。然而僅有60%的肝癌患者在初診時(shí)血清AFP水平升高，其不升高原因未明。研究顯示，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是AFP基因表達(dá)的限速步驟[2]。AFP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控包括啟動(dòng)子，3個(gè)獨(dú)立增強(qiáng)子和2個(gè)沉默子[3]。在遺傳性持續(xù)高AFP血癥(HPAFP)家族中的研究顯示，AFP基因啟動(dòng)子上2個(gè)肝細(xì)胞核因子1A(HNF1A)結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變是非疾病性高AFP血癥的原因[4]。然而，是否HNF1A或其他AFP表達(dá)調(diào)控因子基因突變也與血清AFP水平相關(guān)，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

筆者選擇AFP基因啟動(dòng)子表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子HNF1A、肝細(xì)胞核因子1B(HNF1B)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白A(C/EBPA)基因，以及沉默子區(qū)調(diào)控因子鋅指和同源框蛋白2(ZHX2)基因作為研究靶點(diǎn)，優(yōu)先選擇最小等位基因頻率(MAF)>5%的外顯子錯(cuò)義突變(1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù))，或者已經(jīng)有研究表明與某些性狀或疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)作為研究對(duì)象，在1010例中國(guó)漢族健康成人中，探討HNF1A-rs1169288(A/C，Ile27Leu)和rs2464196(G/A，Ser487Asn)、HNF1B-rs4430796(A/G)、C/EBPA-rs34529039(C/A)和ZHX2-rs7844465(G/T)與血清AFP水平相關(guān)性[3～5]。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:2017年1～11月在筆者醫(yī)院招募了1010例年齡在25～65歲的健康漢族受試者，其中男性615例，女性395例。符合以下任意標(biāo)準(zhǔn)的受試者被剔除：急性或慢性病毒性肝炎感染[乙型肝炎病毒表面抗原和(或)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)陽(yáng)性]，男性飲酒量≥140克/周或女性≥70克/周，妊娠，肝癌和其他惡性腫瘤。從每個(gè)受試者獲得書(shū)面知情同意書(shū)。整個(gè)研究符合赫爾辛基宣言并獲得筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.方法：記錄并測(cè)量所有受試者的年齡、性別、身高、體重，并計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。收縮壓和舒張壓取3次靜息水平測(cè)量的平均值。

采用美國(guó)Philips公司(IU-22型)B型超聲影像儀行腹部B型超聲來(lái)診斷脂肪肝[6]。

采集空腹靜脈血，4h檢測(cè)完畢。使用AU 2700自動(dòng)化學(xué)分析儀(日本Olympus公司)測(cè)量丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。 通過(guò)免疫比濁法測(cè)定(美國(guó)Dade Behring公司)CRP水平。 血清AFP水平通過(guò)美國(guó)雅培公司i2000免疫分析儀測(cè)定，其批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為3.5%～4.7%和4.1%～8.1%。由美國(guó)雅培公司提供配套試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。

3.外周血基因組DNA提取：按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，使用DNA分離試劑盒(中國(guó)天根生化科技有限公司)從EDTA抗凝保存的200μl全血樣品中提取基因組DNA。 提取后的基因組DNA立即在-80℃保存。

4.SNP位點(diǎn)選擇及分型：SNP位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：優(yōu)先選擇最小等位基因頻率(MAF)>5%的外顯子錯(cuò)義突變(1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù))，或者已經(jīng)有研究表明與某些性狀或疾病相關(guān)。共挑選了5個(gè)SNP作為研究目標(biāo)，包括HNF1A-rs2464196、rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465(表1)。

采用等位基因特異性引物結(jié)合TaqMan探針的熒光定量PCR的方法學(xué)(ARMS-TaqMan法)進(jìn)行檢測(cè)[7]。根據(jù)ΔCt值(ΔCt=野生型等位基因反應(yīng)的Ct值減去突變型等位基因反應(yīng)的Ct值)進(jìn)行分型。PCR試劑使用Tiangen Real Master Mix(Probe)試劑盒(中國(guó)天根生化科技有限公司)。使用Primer Premier 5.0軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計(jì)引物和探針，并由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。在所有等位基因特異性引物3′末端-2位置設(shè)計(jì)一個(gè)額外的錯(cuò)配，以加強(qiáng)等位基因特異性區(qū)分。使用ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為20μl，每種成分的體積(終濃度)如下：上、下游引物各1μl(0.25μmol/L)，TaqMan探針1μl(0.25μmol/L)，2×real-master mix 8μl，增強(qiáng)溶液1μl，ddH2O 6μl，DNA模板2μl。除rs34529039外，所有其他反應(yīng)的條件均為95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。 Rs34529039的反應(yīng)條件為97℃ 2min，97℃ 15s， 62℃ 1min，50個(gè)循環(huán)。在1010例受試者中，這5個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型成功率均為100%。為了驗(yàn)證基因分型的準(zhǔn)確性，筆者通過(guò)直接測(cè)序(中國(guó)賽百盛基因技術(shù)有限公司)對(duì)30個(gè)隨機(jī)樣品進(jìn)行重新測(cè)定，兩個(gè)測(cè)試結(jié)果之間一致性達(dá)到100%。

表1 SNP位點(diǎn)ARMS-TaqMan分型法的引物和探針

引物3′端的下劃線斜體堿基是錯(cuò)配堿基，以增加等位基因鑒別的特異性

結(jié) 果

1.1010例研究對(duì)象的基礎(chǔ)資料及SNP位點(diǎn)分布頻率:在1010例健康漢族受試者中，男性和女性之間年齡、LDL-C以及AFP水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。男性BMI、收縮壓、舒張壓、AST、ALT、GGT、TG、CRP、FPG以及脂肪肝水平均顯著高于女性(P<0.05)，而HDL-C和TC水平顯著低于女性(P<0.05)。

基于每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分別將1010例研究受試者分為3組(表2)。 在所有受試者中，rs2464196-A、rs1169288-C、rs4430796-G、rs34529039-A和rs7844465-T的最小等位基因頻率分別為0.479、0.453、0.292、0.007和0.199。男性和女性之間各SNP的等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 所有5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率在總體或不同性別組中均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

P值代表男性、女性性別組間比較

2.不同SNP位點(diǎn)基因型血清AFP水平的變化:如圖1所示，HNF1A-rs2464196 GG、GA和AA基因型之間血清AFP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。rs2464196-AA基因型的平均血清AFP水平為3.60±1.59ng/ml(最低)，AG型為3.92±1.78ng/ml(中間)，GG型為4.21±2.10ng/ml(最高)。3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值為0.000～0.042)。與rs2464196-GG基因型比較，攜帶AA和GA+AA基因型的平均血清AFP水平分別下降了14.5%(P=0.000)和9.5%(P=0.001)。HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465與血清AFP水平之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 5個(gè)SNP位點(diǎn)各基因型血清AFP水平比較誤差條形圖表示根據(jù)SNP位點(diǎn)基因型分層的血清AFP水平，P值為AFP水平進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行組間比較

3.rs2464196等位基因型與血清AFP水平的相關(guān)性分析:如表3所示，以AFP水平作為因變量，不同模型的線性回歸分析顯示，在無(wú)協(xié)變量(模型1，P=0.000)，或調(diào)整年齡、性別和BMI(模型2，P=0.000)，或調(diào)整年齡、性別、BMI、血壓、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝的情況下， 均顯示HNF1A-rs2464196等位基因是血清AFP水平變化的獨(dú)立影響因素(模型3，P=0.000)。

表3 rs2464196等位基因型與血清AFP水平的相關(guān)性

模型1.無(wú)協(xié)變量；模型2.控制年齡、性別和BMI；模型3.控制年齡、性別、BMI、血壓、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝

討 論

本研究首次探討了AFP基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子常見(jiàn)SNP與血清AFP水平的相關(guān)性。 研究結(jié)果顯示，HNF1A-rs2464196基因多態(tài)性與中國(guó)漢族健康成人的血清AFP水平密切相關(guān)，這種相關(guān)性不受年齡、性別、BMI、血壓、血脂指標(biāo)、肝功指標(biāo)、炎性指標(biāo)以及脂肪肝的影響。攜帶rs2464196-A等位基因的個(gè)體可能使它們更傾向于表現(xiàn)為低AFP水平。與攜帶GG等位基因型的人群AFP水平比較，攜帶rs2464196-AA等位基因型者的AFP水平降低了14.5%，GA+AA型攜帶者降低了9.5%。另外，HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465與血清AFP水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HNF1A位于染色體12q24.31上，主要在肝臟中表達(dá)，已經(jīng)在100多種基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了HNF1A潛在的結(jié)合位點(diǎn)[8]。HNF1A在AFP基因表達(dá)的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。基礎(chǔ)研究顯示AFP基因啟動(dòng)子上遠(yuǎn)端HNF1A結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變可以使AFP表達(dá)活性降低約65%，而近端HNF1A結(jié)合區(qū)點(diǎn)突變可以降低50% AFP表達(dá)活性[9]。有研究報(bào)道HNF1A基因突變與CRP、LDL-C、HDL-C以及妊娠期糖尿病相關(guān)[10～12]。

HNF1A由631個(gè)氨基酸組成，包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：①二聚體結(jié)構(gòu)域(氨基酸1～33);②DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包含特異性DNA識(shí)別所需的區(qū)域(氨基酸100～184)和同源結(jié)構(gòu)域(氨基酸198～281);③反式激活結(jié)構(gòu)域(氨基酸282～631)[13]。rs1169288基因多態(tài)性位于HNF1A的二聚體結(jié)構(gòu)域，這個(gè)區(qū)域?qū)τ贒NA的結(jié)合是必需的。因此筆者推測(cè)rs1169288基因多態(tài)性可能會(huì)影響HNF1A蛋白結(jié)合AFP基因的能力，從而影響AFP基因表達(dá)。然而，筆者的結(jié)果顯示rs1169288基因多態(tài)性與血清AFP水平無(wú)顯著相關(guān)。rs2464196位于HNF1A的反式激活結(jié)構(gòu)域，即rs2464196突變可能影響與AFP基因表達(dá)相關(guān)的反式調(diào)節(jié)作用。筆者的結(jié)果顯示rs2464196多態(tài)性與血清AFP水平顯著相關(guān)，表明rs2464196基因多態(tài)性是健康人血清AFP水平的獨(dú)立遺傳決定因素。rs2464196多態(tài)性與血清AFP基因表達(dá)的確切調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

HNF1B基因位于染色體17q12上，編碼一種包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域的POU轉(zhuǎn)錄因子：二聚體結(jié)構(gòu)域、POU DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及反式激活結(jié)構(gòu)域[14]。HNF1B同源二聚體或與HNF1A組成的異源二聚體在脊椎動(dòng)物早期的發(fā)育和存活過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[15]。研究表明，在肝臟發(fā)育過(guò)程中HNF1B早于HNF1A產(chǎn)生，是AFP基因啟動(dòng)子強(qiáng)有力的激活劑。在成年人中，HNF1B的高表達(dá)與血清AFP水平顯著相關(guān)。在原發(fā)漿液性上皮性卵巢癌中的研究顯示與rs4430796高度連鎖不平衡的rs757210與HNF1B啟動(dòng)子的低甲基化有關(guān)，可導(dǎo)致HNF1B表達(dá)增加[16]。筆者的研究表明rs4430796與血清AFP水平無(wú)關(guān)。然而，應(yīng)該注意的是，雖然rs4430796不同基因型間AFP水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是rs4430796-AA、AG和GG基因型的AFP水平呈上升趨勢(shì)。考慮到本研究中AA基型人群數(shù)量明顯少于GG型(70例 vs 491例)，因此rs4430796與血清AFP水平的相關(guān)性仍需增加樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

C/EBPA基因是位于染色體19q13.11上的無(wú)內(nèi)含子基因，通過(guò)與AFP基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的結(jié)合反式激活A(yù)FP基因表達(dá)[17]。直接點(diǎn)突變分析顯示，在缺乏增強(qiáng)子Ⅰ的情況下，AFP基因Ⅰb(C/EBP)和Ⅱ(核因子1或C/EBP)區(qū)域的突變會(huì)顯著降低AFP基因啟動(dòng)子活性，而Vb(C/EBP)區(qū)域突變對(duì)AFP基因啟動(dòng)子有輕微的抑制作用[9]。少量研究表明C/EBPA基因多態(tài)性(rs34529039)與卵巢癌相關(guān)[18]。但迄今為止，還沒(méi)有研究表明C/EBPA基因多態(tài)性是否與血清AFP水平相關(guān)。根據(jù)ExAC或1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)，rs34529039-A的最小等位基因頻率分別為0.2143/39和0.1328/665。但在筆者的研究結(jié)果中，中國(guó)健康成人rs34529039-A的最小等位基因頻率僅為0.007/1010。這表明該SNP位點(diǎn)的等位基因頻率在不同種族人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究由于A等位基因頻率太低，筆者無(wú)法得出明確的結(jié)論。

ZHX2位于15號(hào)染色體上，參與出生后AFP基因的表達(dá)調(diào)控。研究表明，ZHX2可能通過(guò)影響AFP基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)控制成人肝臟中AFP基因的低表達(dá)水平，即ZHX2基因的表達(dá)產(chǎn)物是AFP基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控因子，但這種調(diào)控作用主要發(fā)生在正常肝臟中[5]。有研究報(bào)道ZHX2基因多態(tài)性(rs7844465)與內(nèi)膜中層厚度相關(guān)[19]。筆者的研究表明rs7844465與血清AFP水平無(wú)關(guān)。

本研究存在一定的局限性。首先，樣本量不夠大，未檢測(cè)到某些基因型，例如rs34529039-AA基因型，這可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效力的降低。因此，筆者的研究應(yīng)被視為初步揭示血清AFP水平與HNF1A、HNF1B、C/EBPA和ZHX2基因多態(tài)性相關(guān)性的研究。其次，筆者的研究結(jié)果來(lái)自于中國(guó)漢族人群，需要進(jìn)一步在不同種族中進(jìn)一步研究。最后，筆者研究的是健康人群，考慮到約40%的HCC患者血清AFP水平不升高，還應(yīng)在HCC患者中做進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，還需要更大規(guī)模更深層次的綜合性研究來(lái)證實(shí)基因多態(tài)性與血清AFP水平的相關(guān)性。

綜上所述，本研究在中國(guó)漢族健康人群中發(fā)現(xiàn)HNF1A-rs2464196與血清AFP水平顯著相關(guān)，rs2464196-A等位基因攜帶者更傾向于表現(xiàn)為低水平AFP。而HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs4430796與血清AFP水平無(wú)顯著相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為AFP的遺傳決定因素提供了新的見(jiàn)解，并可能幫助進(jìn)一步了解某些HCC患者中AFP水平不升高的潛在機(jī)制。