Hedgehog通路介導(dǎo)HL60細胞生物學(xué)功能的影響分析

苗玉迪 李艷春 李慶瑞

白血病是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)是發(fā)生率最常見的白血病類型，約占所有白血病的60%[1，2]。目前針對AML的治療主要是應(yīng)用化療藥物與放射治療，促進白血病患者緩解率增加、病死率降低，但是很多患者由于對化療藥的耐受，導(dǎo)致治療失敗[3，4]。難治性AML是用標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)緩解方案治療2個療程未達完全緩解者，也包括多次復(fù)發(fā)者，這類患者對于放射線和化療藥物具有較強抵抗性，對于治療的要求更高[5]。

目前難治性AML的發(fā)病機制還不明確，被認為是多種因素共同作用的結(jié)果[6]。現(xiàn)代研究表明，多條信號通路交互作用是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要過程，可涉及多條信號通路的調(diào)控[7]。Hedgehog通路可參與血管生成、干細胞分化、胚胎發(fā)育、器官成熟，其異常活化與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、膀胱癌等[8]。Hedgehog通路中的SHh、DHh、IHh 3個配體可與效應(yīng)細胞表面的Patched(PTCH)蛋白結(jié)合，促進信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活下游一系列因子的過程[9]。當(dāng)前研究表明Hedgehog通路可存在于骨髓基質(zhì)細胞，Sonic Hedgehog(SHH)信號通路可參與骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)細胞分化過程中，但是可被Hedgehog通路抑制劑Cyclopamine抑制[10]。生物信息學(xué)表明Hedgehog通路在難治性AML細胞中表達顯著高于非難治性急性白血病，可能在難治性AML治療反應(yīng)中具有重要作用[11]。本研究具體探討了Hedgehog通路介導(dǎo)難治性AML生物學(xué)功能的影響，以分析Hedgehog通路具有介導(dǎo)白血病細胞治療耐藥性與放射抵抗的作用機制。現(xiàn)總結(jié)報道如下。

材料與方法

1.研究材料:人多藥耐藥的白血病HL60/ADR細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，放射抵抗的HL60/RX細胞株由購自上海生化研究所。都在在37℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%的胎牛血清的DEMD。每2～3天進行傳代或者換液培養(yǎng)，選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。Hedgehog通路抑制劑GANT-61均購自德國Merck公司，DMSO溶解至保存濃度保存。

2.細胞分組:設(shè)置GANT-61的濃度依次為0、10、50、100μmol/L，細胞株按孵育時間的不同分為24、48h。每個實驗組內(nèi)均采用110、50、100μmol/L濃度處理細胞，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。

3.CCK-8檢測細胞增殖活性：將96孔板中處理組及對照組細胞約1×106鋪入各孔，將培養(yǎng)體系調(diào)整為100μl培養(yǎng)24、48h后向每孔加入10μl CCK-8溶液在37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后，測定吸光光度值，酶標(biāo)儀波長調(diào)至450nm。

4.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：取待測細胞5×105個，PBS洗滌離心，加入500μl Binding Buffer、5μl Annexin Ⅴ和5μl PI，30min后用流式細胞儀檢測。

5.克隆形成檢測細胞存活:取對數(shù)生長期細胞，使用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用不同濃度GANT-61處理后，在培養(yǎng)24、48h后使用倒置顯微鏡觀察克隆形成情況，克隆形成率(%)=(集落形成個數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

6.Western blot法檢測細胞表達:吸取待測細胞約5×106個左右，離心后取細胞，采用細胞裂解液進行裂解，采用BCA法測量蛋白濃度，按照40μg上樣每孔，按照Western blot法測定GAPDH、pAKT、AKT、NF-κB蛋白表達水平。

結(jié) 果

1.細胞增殖活性比較：在GANT-61 10～100μmol/L的不同實驗組中，隨著作用時間延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞抑制率顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細胞抑制率比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

2.細胞凋亡指數(shù)比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞凋亡指數(shù)顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細胞凋亡指數(shù)比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

3.克隆形成指數(shù)比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞的集落生成數(shù)目都顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細胞集落生成數(shù)目比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

4.蛋白表達比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞的pAKT表達顯著下降，NF-κB表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細胞相關(guān)蛋白表達比較

討 論

現(xiàn)代研究表明多條信號通路相互交叉是難治性AML發(fā)生、發(fā)展的一個重要機制[12]。Hedgehog蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅胚胎中，其具有3個同源性基因，包括Deserthedgehog(Dhh)、Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)等基因。Hedgehog通路由Hedgehog信號分子、Smoothened(Smo)、核轉(zhuǎn)錄因子Gli、膜受體patched(PTCH)等作用[13，14]。正常情況下，PTCH與Smo結(jié)合處于失活狀態(tài)[14]。當(dāng)Hedgehog通路激活后，激活的Smo與Gli結(jié)合，Hh配體與PTCH結(jié)合并內(nèi)吞，促使Gli蛋白進入核內(nèi)持續(xù)性激活，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄[15]。Hedgehog通路是胚胎發(fā)育和器官形成過程中重要的信號通路蛋白，在細胞生長發(fā)育、損傷修復(fù)再生中發(fā)揮重要作用，Hedgehog通路也是腫瘤細胞生成、轉(zhuǎn)移、增殖中重要的信號傳導(dǎo)通路。Hedgehog通路中Smo的特異阻斷劑環(huán)巴胺對淋巴瘤有顯著抑制作用，但對AML的作用卻不顯著[16]。Gli作為Hedgehog通路的關(guān)鍵物質(zhì)，當(dāng)前一些以Gli為靶點的抑制劑也得以發(fā)現(xiàn)。GGANT-6可以干擾Gli蛋白與細胞核內(nèi)DNA的結(jié)合，從而下調(diào)Hedgehog通路的作用[17]。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞的凋亡指數(shù)與細胞增殖抑制率顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)研究也表明Hedgehog通路的Gli蛋白表達與急性髓細胞白血病患者的無病生存率、無復(fù)發(fā)生存率、總生存率呈負相關(guān)，抑制該通路表達可以提高抗腫瘤治療作用[18]。

Hedgehog是哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的一種分泌性蛋白，Hedgehog通路與腫瘤細胞的凋亡、血管形成、增殖、分化密切相關(guān)，當(dāng)Hedgehog通路調(diào)節(jié)失控，促使Gli蛋白持續(xù)性激活、啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄[19]。當(dāng)使用抑制劑阻滯Hedgehog通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后，抵抗射線的細胞對射線的敏感度顯著提高，提示Hedegehog通路在難治性AML治療抵抗方面可能發(fā)揮重要作用[20]。集落生成實驗可反映單個腫瘤細胞增殖能力，其中單個細胞體外增殖6代以上，其后代形成的細胞集落被稱為克隆。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞的集落生成數(shù)目都顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)研究表明GANT-61可直接作用于Hedgehog通路的轉(zhuǎn)錄因子Glil/2，特異性地阻滯Glil/2所介導(dǎo)的下游靶基因激活，從而抑制腫瘤細胞的增殖[21]。還有研究表明Hedgehog通路阻斷劑Cyclopamine也顯著降低效應(yīng)蛋白Gli-1的表達水平，繼而顯著增加胰腺癌細胞的放射敏感度，表現(xiàn)為腫瘤的放射效應(yīng)顯著增加，因此推測該信號通路將會是臨床上增加難治性AML放射敏感度的潛在靶點[22]。

Hedgehog通路與腫瘤細胞增殖、凋亡、促進血管形成密切相關(guān)，參與白血病的發(fā)生、發(fā)展。Hedgehog通路的下游靶基因主要包括癌基因N-myc、AKT、NF-κB等[23]。研究表明Hedgehog通路可以通過PI3K/AKT途徑來行使促進細胞生長、增殖、遷移作用，并與NF-κB信號活化具有相互促進作用[24]。腫瘤細胞PI3K/AKT信號通路可以通過激活多種下游靶蛋白而發(fā)揮其功能，其中pAKT激活I(lǐng)κB激酶，降解IκB而使NF-κB活化進入細胞核而促進惡性腫瘤細胞生長。相關(guān)研究也表明PI3K/AKT通路的活化與腫瘤的耐藥和放射抵抗均有相關(guān)性，抑制該通路的活性可以逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性，增強放射敏感度。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時間的延長，HL60/ADR與HL60/RX細胞的pAKT表達顯著下降，NF-κB表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明抑制Hedgehog通路可抑制AKT的活化，使得NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)行使其功能，從而抑制細胞增殖與促使腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，Hedgehog通路可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB途徑，抑制難治性AML細胞的增殖，促進細胞調(diào)查，對臨床治療難治性AML提供一個潛在的有效方法。