乳腺癌中SyK、HGF表達的相關性及預后的關系

莊曉蘋 林瓊瓊 季劍樂 朱 暐

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在國內發生率明顯上升，且發病年齡有低齡化的趨勢，其具體發病原因及機制尚未完全闡明[1]。脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase，SyK) 目前引起了國內外研究者的廣泛重視，認為SyK基因是一種新發現的候選抑癌基因，可以預測乳腺癌預后情況的指標之一。有研究表明肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)異常表達提示腫瘤的預后不良及低生存率[2]。本研究通過實時PCR檢測SyK、HGF mRNA在乳腺癌中表達情況，進而探討SyK、HGF在乳腺癌侵襲和轉移中的作用以及預后的相關性。

材料與方法

1.標本來源：收集于2012～2015年筆者醫院病理科石蠟標本，正常乳腺組織100例，纖維腺瘤100例，乳腺癌組織120例。收集的病例均有完整的臨床病理資料和隨訪資料(表1)。根據2012年第4版的WHO乳腺腫瘤分類[3]，按照分析乳腺小管和腺體的分化程度、腫瘤細胞核的多形性、病理核分裂象計數等進行腫瘤分級：組織學分級Ⅰ、Ⅱ級者72例，Ⅲ級者48例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期者75例，Ⅲ期者45例；有脈管侵犯者34例、無侵犯者86例；腋窩淋巴有結轉移者43例、無轉移者77例。患者術前均未接受任何治療方案，包括放射治療、化學治療或激素治療。

表1 乳腺癌組織中SyK、HGF mRNA表達和臨床病理學參數之間的關系

2.檢測試劑：Total試劑購自于美國Invitrogen公司；石蠟標本RNA分離和擴增試劑盒購自美國Ambion公司；引物設計和合成均由上海生物工程有限公司制作。

3.研究方法：(1)石蠟標本RNA提取法：將切下的蠟膜放在二甲苯中，室溫孵育10min，石蠟混勻顛倒，使組織得到充分溶解。用100%無水乙醇洗滌2次，去除殘留的二甲苯，然后干燥呈片狀沉淀物[4]。(2)RNA提取及純化：按照RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE試劑盒的說明書步驟提取總RNA。(3)RNA 溶解：純化后的RNA 用60U/L elution溶解, 分裝。用20μl來檢測RNA 質量與反轉錄，剩余的標本保存-80℃冰箱備用。(4)實時PCR方法：用TRIzol 法提取標本總RNA，反轉錄反應按照試劑盒說明書進行操作。PCR反應以25μl為體系，取cDNA 2μl，加入試劑 10×buffer 2.5μl、dNTP 0.5μl、MgCl21μl及TaqDNA 聚合酶0.3μl。SyK上游引物: 5′-CATGGAAAAATCTCTCGGGAAGA-3′, 下游引物: 5′-GTCGATGCGATAGTGCAGCA-3′；HGF上游引物: 5′-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3′, 下游引物: 5′-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3′；內參β-actin上游引物: 5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下游引物: 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。上下游引物各加0.75μl、純凈水16.4μl。反應條件： 94℃預變性10min、94℃變性30s、54℃退火30s，72℃延伸1min 45s，35個循環；72℃終末延伸10min。用DEPC水代替cDNA 做陰性對照，用擴增GAPDH 作為內參照。

4.結果判定：用實時PCR檢測石蠟標本中SyK、HGF mRNA相對表達量，應用2-ΔΔCt法分析目的基因和內參基因的Ct值，以GAPDH為內參基因，以正常乳腺組織為對照組，SyK、HGF相對表達量公式計算：folds=2-ΔΔCt，ΔΔCt= (Ct目的基因-Ct內參照基因)研究組- (Ct目的基因-Ct內參照基因)對照組，通過計算乳腺癌組織中SyK、HGF mRNA相對于正常乳腺組織、纖維腺瘤表達之間的差異性[4,5]。

5.隨訪結果：隨訪截止時間為2017年5月31日，共隨訪患者120例，隨訪時間 1～60個月，生存中位數為47個月。120例患者中無病生存88例，出現局部復發或遠處轉移共24例，死于乳腺癌復發轉移5例，死于其他原因3例。

結 果

1.SyK、HGF mRNA不同乳腺組織相對表達量:SyK mRNA正常乳腺組和纖維腺瘤組相對表達量為(t=0.978,P=0.333)；正常乳腺組和乳腺癌組相對表達量為(t=40.810,P<0.01)；纖維腺瘤組和乳腺癌組相對表達量為(t=34.240，P<0.01)。HGF mRNA正常乳腺組和纖維腺瘤組相對表達量為(t=2.248,P=0.029)；正常乳腺組和乳腺癌組相對表達量為(t=3.760,P=0.000)；纖維腺瘤組和乳腺癌組相對表達量為(t=3.371,P=0.001)。相對表達量符合正態分布(P>0.05)，SyK、HGF mRNA乳腺癌相對表達量明顯高于正常乳腺組和纖維腺瘤組，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01,圖1)。

圖1 SyK、HGF mRNA在不同乳腺組織的相對表達量

2.SyK、HGF mRNA表達和乳腺癌組織臨床病理學參數之間的關系:SyK、HGF mRNA表達與乳腺癌的臨床分期、有脈管侵犯相關(P<0.05)，但與年齡、腫塊直徑無關(P>0.05)。其中SyK與組織學分級相關(P<0.05)，HGF與淋巴結轉移相關(P<0.05，表1)。

3.乳腺癌中 SyK、HGF 的表達與患者生存的關系:120例乳腺癌患者的隨訪結果為術后5 年內死亡人數為8例，占6.67%(8/120)，生存中位數時間為47個月，根據乳腺癌SyK、HGF的表達狀況將患者分為兩組:(1)比較組：SyK+/HGF+(18例)、SyK+/HGF-(10例)、SyK-/HGF-(15例)。(2)預后組：SyK-/HGF+(77例)；因比較組的3組數據較小，合并成一組為比較組。采用Kaplan-Meier法對120例乳腺癌患者的隨訪結果進行統計學分析處理,結果顯示對兩組生存曲線整體比較的LogRank檢驗結果為P=0.009，Breslow檢驗結果為P=0.018。LogRank檢驗的結果顯示，兩組表達對患者的生存率有差異，預后組與生存狀態負相關(r=-0.202，P<0.05)，該兩組5年生存情況生存曲線，詳見圖2。

圖2 SyK、HGF不同表達與乳腺癌患者生存時間的關系

討 論

研究證明，乳腺癌的發生、浸潤、侵襲及轉移是多因素參與、多基因調控、多步驟發展的復雜過程，且與許多生物學指標密切相關[6]。SyK是一種備選抑癌基因，其表達的缺失引起免疫細胞發育成熟障礙，使機體的免疫監視能力逐漸下降，致使機體對基因突變、細胞的異常增生失去免疫力，從而引發腫瘤[7]。臨床及實驗研究發現SyK表達下調或缺失與多種惡性腫瘤的浸潤、侵襲及轉移密切相關，如結腸癌、肺癌、鼻咽癌、視網膜母細胞瘤等惡性腫瘤中均表明SyK表達下調或缺失，惡性程度越高的腫瘤SyK表達缺失的現象越明顯[8～11]。本研究SyK mRNA在乳腺癌中表達明顯低于正常乳腺組和纖維腺瘤組，兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)，說明SyK表達下調或缺失與乳腺惡性腫瘤發生有著密切關聯。正常乳腺組織、纖維腺瘤中SyK高表達，可能提示SyK對體內腫瘤細胞的發生、發展有一定的抑制作用，從而維持良性的組織學特性。在臨床病理參數中，SyK mRNA表達缺失與乳腺癌的臨床分期、組織學分級、脈管侵犯相關(P<0.05)，這與 Ghotra等[12]研究結果相符。乳腺癌臨床分期越晚、組織學分級越差、有脈管侵犯者等SyK表達缺失越嚴重，這說明SyK表達缺失的現象與乳腺癌具有更高的侵襲性、轉移以及預后不良因素密切相關。

HGF是屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，具有多種生物學效應的一種血源性生長因子,能促進淋巴管的生成和血管內皮細胞的增殖。正常組織存在低表達，在惡性腫瘤組織呈高表達[13]。研究顯示，HGF過表達與配體c-Met 相結合作用，可通過旁分泌或自分泌途徑激活多種信號通路，引起直接或間接反應，從而刺激腫瘤發生、浸潤及轉移[14]。研究證實，HGF在黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、惡性間皮瘤等惡性腫瘤中均呈高表達[15～18]。本研究HGF mRNA在乳腺癌中明顯高于正常乳腺組和纖維腺瘤組，兩者比較，差異有統計學意義(P<0.01)，各項臨床參數中HGF mRNA表達與乳腺癌的臨床分期、淋巴結轉移、有脈管侵犯者相關(P<0.05)，與Hao等[19]研究結果相一致。這結果提示HGF高表達促進腫瘤細胞的增殖、癌變，同時又促進血管內皮細胞增生，導致惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。HGF與淋巴結轉移相關，提示HGF可能有促進淋巴管的增生，增加腫瘤與淋巴管之間的接觸面積，便于腫瘤細胞進入淋巴管的機會，從而導致淋巴結轉移。淋巴結轉移是乳腺癌的主要轉移方式，也是乳腺癌死亡或復發的重要因素，進一步說明HGF過表達是乳腺癌的早期發現、早期診斷以及判斷預后不良的指標之一。

在乳腺癌傳統的預后判定指標有：年齡、腫塊直徑、組織學分級、臨床分期等，臨床情況相同的患者中，卻有著不同的預后結果，因此不能根據傳統的預后指標來判斷，并且制定治療方案，應要結合其他生物學指標，比如SyK、HGF等指標進行綜合判斷。本研究根據乳腺癌中SyK、HGF 的表達情況將患者分為比較組與預后組(SyK-/HGF+)，采用Kaplan-Meier法對120例乳腺癌患者的隨訪結果進行統計學分析處理,結果顯示對兩組生存曲線整體比較的LogRank檢驗結果為P=0.009，Breslow檢驗結果為P=0.018。按照LogRank檢驗的結果，SyK和HGF表達與否對患者的生存率有顯著影響，預后組與生存狀態呈負相關(r=-0.439，P<0.05)，從生存曲線圖可知，乳腺癌患者中SyK缺失或HGF過表達者，其患者生存時間均低于SyK高表達或HGF低表達者。說明患者SyK表達的越低、HGF表達的越高，提示腫瘤的惡性程度就越高，加速腫瘤向遠處轉移的概率會更大，患者預后會更差。因此可以說明SyK和HGF是預后獨立因素，可作為乳腺癌預后判斷的指標之一。