胸腔積液凝集物在組織脫落細胞學診斷中的應用

連國亮 陳 東 商建峰 李彥瑋 李 倩

對于有胸腔積液的患者， 常常要抽出積液做細胞學檢查， 以證實是否有惡性腫瘤細胞。在常規細胞學診斷中常用直接離心涂片法。但實際應用中，筆者發現涂片法存在涂片厚、細胞重疊、結構不清、細胞量少而陽性檢出率低等缺點。特別是對細胞形態不典型的間皮細胞、轉移癌細胞的鑒別僅用直接離心涂片法是難以勝任的，常需做免疫組織化學染色檢查才能確診[1～3]。但是直接用涂片做免疫組織化學染色時，常會出現背景深、非特異性著色、陽性不可靠等缺點[4]。近年來細胞蠟塊制作的普及已經可以彌補胸腔積液直接涂片不足，但是細胞蠟塊的制作步驟繁多，受操作人員技術限制，細胞量可能不能滿足診斷工作的需要，因此選取筆者所在科室2015～2017年住院患者胸腔積液298例，其中產生凝集物的標本105例，采用胸腔積液涂片與細胞蠟塊及凝集物切片聯合檢查，凝集物診斷價值可取代復雜的細胞蠟塊制作，取得了較滿意的效果。現報道如下。

資料與方法

1.一般資料：筆者所在科室2015～2017年住院患者胸腔積液(298例)產生凝集物的標本(105例)，其中男性標本64例，女性標本41例。標本呈深黃色渾濁、淺黃色渾濁、血性，并有膠凍狀懸浮狀態的凝集物。臨床診斷惡性腫瘤胸腔積液88例，胸腔積液原因待查17例。

2.試劑和儀器：CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等免疫組織化學試劑購自中山金橋生物技術公司，HE染色套裝購自格林環保試劑公司，10%中性甲醛溶液購自北京益利精細化學，95%乙醇購自北京通廣精細化學。Leica Bond-MAX全自動免疫組織化學工作站，萊卡染色封片機。

3.細胞涂片制作方法：取胸腔積液30ml，2500r/min，離心5min，棄上清，取沉淀物在載玻片上采用推拉法進行制片，陰干至不能見明確水分后在95%乙醇內固定15min，然后進行HE染色。

4.細胞蠟塊的制作：取胸腔積液100ml分裝在兩個離心管中，2500r/min，離心5min，棄上清，分別取沉淀物放入10ml軟離心管中并加入10%中性甲醛溶液，混勻，2500r/min，離心5min，靜置20min。棄上清，加入95%乙醇，混勻，2500r/min，離心5min，靜置20min后，定型后可得到圓形細胞塊，進行脫水處理。

5.凝集物的收集：用鑷子夾取胸腔積液中的凝集物，進行取材，脫水。

6.染色方法：將細胞塊和凝集物包埋、切片后，進行HE染色及免疫組織化學CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等染色。

7.統計學方法：采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析處理，兩組間計量資料的比較采用配對t檢驗， 相關性分析以Pearson相關系數表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

105例臨床送檢有凝集物的胸腔積液標本其中采用細胞涂片方法可診斷惡性腫瘤84例，其中5例判斷不清，16例非腫瘤性間皮增生。采用細胞蠟塊及凝集物制作蠟塊的方法均可診斷惡性腫瘤88例，17例非腫瘤性間皮增生，二者診斷結果完全一致。

凝集物制作蠟塊與細胞涂片比較顯示，細胞量豐富，HE染色色彩鮮艷、胞質、核仁清晰，詳見圖1、圖2。

凝集物蠟塊與細胞蠟塊進行免疫組織化學染色CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等陽性顆粒定位于細胞膜或細胞質,兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，結果完全一致。詳見圖3～圖6。腫瘤脫落細胞診斷結果詳見表1，免疫組織化學染色結果詳見表2。

討 論

隨著先進的細胞制備技術的發展，在常規的胸腔積液細胞學檢查中，采用的方法是將胸腔積液離心，棄去上清液和凝塊物，取沉渣涂片2 張，鏡檢，許多實驗室已經摒棄細胞蠟塊技術，在筆者看來此種忽視并非合理。細胞蠟塊技術應當用于處理細胞學制備完成后的所有殘留物質。這些物質常常是包含有價值的診斷證據和不能被細胞學技術所處理的組織碎片。Richardson等研究顯示，如果用殘留物質的細胞塊切片補充涂片技術，那么有5%的液體標本可額外診斷出癌癥[5，6]。

圖1 細胞涂片(HE染色)A.×10;B.×40

圖2 凝集物蠟塊(HE染色)A.×10;B.×40

圖3 凝集物蠟塊(calretinin,×40)

圖4 凝集物蠟塊(p40,×40)

圖5 凝集物蠟塊(p63,×40)

圖6 凝集物蠟塊(TTF-1,×10)

表1 105例胸腔積液細胞涂片、細胞蠟塊與胸腔積液凝集物HE染色診斷結果比較(n)

組織活檢n惡性腫瘤腺癌(n)鱗癌(n)非腫瘤間皮細胞無法判斷細胞涂片1055628165細胞蠟塊 1055830170腔腔積液凝集物1055830170

表2 陽性細胞檢出率、著色強度及背景著色的檢測結果

一個原發或轉移腫瘤的重要診斷標志是會出現血色或淡紅色滲出液，而滲出液以較高的蛋白含量(通常高于30g/L)為特征，富含纖維蛋白質，靜置易于凝固，人們認為它是由纖維蛋白組成，不利于作細胞學涂片，所以凝塊物被棄去，但是滲出液中包含各種不同但有診斷價值的細胞團被凝集物包裹、吸附。

筆者選取懸浮狀態的凝集物，比重接近胸腔積液，其成分還有待于繼續研究，凝集沉淀于瓶底凝集物經過試驗發現其大多為血小板凝集產物，吸附或包裹細胞極少，所以不能采用。含有懸浮狀態凝集物的胸腔積液占總體送檢胸腔積液的35.23%，采取替代細胞蠟塊制作可提高工作效率，降低人員勞動強度。

細胞涂片做免疫細胞染色時可能出現如下情況：①由于經過95%乙醇固定，對可能損失某些抗原；②組織內含有H2O2酶，在洗滌的時候可造成脫片；③細胞比較分散，耗費試劑，而且容易出現邊緣現象。當面對含有凝集物的胸腔積液時，傳統細胞蠟塊制作步驟繁多，受操作人員技術限制，獲得細胞量可能不能滿足診斷需要。筆者將凝集物直接包埋，脫水，不受技術員操作的影響，并且獲得豐富的細胞量，組織抗原保持完整，細胞集中。

胸腔積液凝集物包埋切片法收集到的有核細胞多、細胞結構清晰，與細胞涂片相結合，大大提高了細胞學的陽性檢出率，對細胞量較少的標本，意義更大。用胸腔積液凝集物做免疫組織化學染色，可連續切片，有利于多種抗體組合運用或對某一特定細胞的比較觀察，陽性顆粒為棕黃色，定位準確可靠、背景清、可重復性高，提高了疑難病例診斷的準確率[4]。

據細胞涂片HE染色對惡性腫瘤及疑似腫瘤和間皮細胞做以下免疫組織化學染色，鈣結合蛋白染色，間皮瘤有表達，在間皮瘤與肺腺癌的診斷中具有一定的價值，而腺癌極少表達(9.8%)[7，8]。本研究中1例腺癌細胞蠟塊及凝集物蠟塊均表達陽性結果。細胞角蛋白(CK)染色可作為上皮源性腫瘤的重要標志物，但不能完全區分腺癌與間皮瘤。波形蛋白(vimentin)染色是間葉源性腫瘤細胞的標志物，因此可用于區分腺癌與間皮瘤[9，10]。肺腺癌免疫組化通常CK7、Napsin A和TTF-1 均呈陽性[11～15]。肺鱗癌免疫組化標記CK、p40、CK5/6、p63均呈陽性[16]。筆者應用一組抗體進行檢測比較，不僅提高了診斷的陽性率，而且對腺癌和惡性間皮瘤起到鑒別診斷作用。同時胸腔積液中增生或退變的間皮細胞與某些惡性細胞尤其是腺癌細胞在形態上易于混淆，給診斷帶來困難。將免疫組織化學用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷，結果直觀，較易判斷[17～19]。

胸腔積液凝集物制作蠟塊的方法簡單，與細胞涂片相結合，對于組織脫落細胞良惡性很好鑒別， 使診斷結果準確可靠，防止漏診、誤診，為臨床治療提供明確依據[20]。胸腔積液凝集物制作成的蠟塊，可以提供樣本結構性的信息，還可以用作免疫組織化學和特殊染色以及分子檢測。所以沒有任何理由丟棄胸腔積液中的凝集物，這樣可以以最低的代價獲得后續輔助研究的理想對象。對于含有懸浮凝集物的胸腔積液標本，完全可以用凝集物替代細胞蠟塊的制作。