食管癌組織環狀-TTBK2和miR-217表達及臨床病理意義

徐勇軍 彭 琴 譚崢嶸 龍丹丹 魏亞元 徐繼宗

食管癌(esophageal cancer)是由于食管上皮組織異常增生引起的一種常見消化道惡性腫瘤。流行病學研究表明，我國是食管癌高發地區，每年新增病例約占世界發病人數的一半[1]。由于食管癌早期癥狀不典型，多數患者確診時已發展至中晚期，錯過最佳治療時機，預后效果差，病死率較高[2]。不良飲食習慣、環境因素及遺傳易感因素等均可能導致食管癌的發生，但其發病的具體機制尚不清楚。因此，研究食管癌發生發展的機制，尋找防治食管癌的有效生物學靶標，可為食管癌的早期診斷、臨床治療及預后提供新思路。多項研究表明，微小RNA(miRNAs)參與多種生理生化過程，其異常表達與炎癥、癌癥等多種疾病的發生相關[3]。Li等[4]發現，miR-217在人卵巢上皮癌組織中顯著下調表達，過表達miR-217可促進卵巢上皮癌細胞的生長和遷移，但關于miR-217與食管癌的關系研究較少。

近年來研究表明，基因在轉錄時并不總是產生線性RNA，也會形成一些3′末端與5′末端相連的非編碼環狀RNAs，環狀RNAs結構穩定，在血液和組織中與核內體或微囊結合，可作為疾病的生物學標志物[5]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種參與重要細胞過程的多功能激酶，維管系統參與多種細胞功能，是神經細胞骨架主要成分，Tau具有穩定微管的作用，在微管相關蛋白中含量最高，TTBK2環狀RNA通過調節miR217等途徑調控膠質瘤惡性[6]。因此，本研究通過檢測并比較miR-217、環狀-TTBK2在食管癌腫瘤組織與癌旁組織中的表達情況，探討二者與食管癌臨床病理特征及預后的關系。

材料與方法

1.標本采集:選取2013年3月～2015年3月筆者醫院病理科收集的食管癌患者術后腫瘤組織及對應癌旁組織標本各69例為研究對象，患者年齡47～79歲，平均年齡59.67±10.23歲，其中食管病變部位：上段11例，中段40例，下段18例；病理類型：57例鱗癌、12例非鱗癌；腫瘤分化程度：高分化患者14例、中分化患者21例、低分化患者34例；浸潤深度：T1～T2患者30例，T3～T4患者39例；淋巴結轉移患者41例，淋巴結無轉移患者28例；根據國際抗癌協會TNM分期標準，Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期36例[7]。對所有入選患者進行為期3年的隨訪，并做好記錄，隨訪日期截止2017年4月30日。納入標準：①經病理診斷首次確診為食管癌患者的組織標本；②年齡不超過80歲患者的組織標本；③明確TNM分期及病理分化標本；④癌旁組織距腫瘤病灶組織距離超過5cm的組織標本；⑤患者的臨床及隨訪資料完整。排除標準：①非首次確診食管癌患者；②轉移性食管癌患者；③其它惡性腫瘤；④術前行放化療等其他輔助治療患者；⑤臨床或隨訪資料不完整患者。于術中分別收集食管癌腫瘤組織和癌旁組織，切成小塊(每塊體積1.0cm×1.0cm×1.0cm)，沖洗干凈后置于Trizol試劑中，-80℃保存。該研究經過筆者醫院醫學倫理學委員會批準通過，標本采集和研究過程均符合赫爾辛基宣言。

2.主要試劑與儀器:Trizol試劑購自日本TaKaRa公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京vazyme生物公司；MystiCq?microRNA qPCR Assay Primer購自美國Sigma公司；qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成等；qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司等。

3.實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-217、環狀-TTBK2表達水平：Trizol法提取兩組食管組織總RNA，反轉錄獲得cDNA。按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒說明書對miR-217、環狀-TTBK2進行擴增。反應體系：正、反向引物(10μmol/L)各0.5μl，SYBR?Green Mix 5.0μl，cDNA(50ng/μl)1.0μl，ddH2O 3.0μl，共10.0μl。反應條件：95℃，90s；95℃，30s；62℃，30s；72℃，20s；40個循環，采用qRT-PCR儀進行檢測，通過溶解曲線評價qRT-PCR擴增產物的特異性。反應結束后，采用2-ΔΔCT法對擴增結果進行定量分析。qRT-PCR引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

結 果

1.食管腫瘤組織及癌旁組織中miR-217、環狀-TTBK2表達水平的比較:食管癌腫瘤組織中miR-217相對表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；食管癌腫瘤組織中環狀-TTBK2相對表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 不同食管組織中miR-217、環狀-TTBK2 表達水平的比較

2.食管癌患者腫瘤組織中miR-217與環狀-TTBK2表達的相關性:Pearson分析結果顯示，食管癌患者腫瘤組織中miR-217與環狀-TTBK2表達呈顯著負相關(r=-0.609)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 食管癌患者腫瘤組織miR-217與環狀-TTBK2表達的相關性

3.食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環狀-TTBK2表達情況與臨床病理特征的關系：以69例食管癌患者腫瘤組織中miR-217和環狀-TTBK2的平均水平為截斷值，將患者分為miR-217低表達組41例，miR-217高表達組28例，環狀-TTBK2低表達組26例，高表達組43例。不同年齡、性別、病變部位、病理類型、腫瘤浸潤深度的食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環狀-TTBK2表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況的食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環狀-TTBK2表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

4.不同miR-217、環狀-TTBK2表達食管癌患者3年總生存率的比較:如圖2所示，miR-217低表達者3年存活率為41.46%(17/41)，明顯低于miR-217高表達者3年存活率78.57%(22/28,χ2=9.238，P<0.05)；環狀-TTBK2高表達者3年存活率為37.21%(16/43)，明顯低于環狀-TTBK2陰性表達者3年生存率88.46%(23/26，χ2=15.780，P<0.05)。

5.影響食管癌患者預后的COX回歸分析:本研究將患者miR-217表達、環狀-TTBK2表達、年齡分層、性別、病變位置、病理類型、浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結轉移、TNM分期等因素，納入影響食管癌患者預后的COX比例風險模型進行分析。單因素分析結果顯示，miR-217表達、環狀-TTBK2表達、浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結轉移、TNM分期是影響食管癌患者預后的危險因素，詳見表4。多因素分析顯示，miR-217表達、環狀-TTBK2表達、TNM分期是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，詳見表5。

討 論

食管癌是臨床上一種較為常見的消化道惡性腫瘤，多發生于40歲以后，其典型臨床癥狀是進行性吞咽困難。據報道，目前我國食管癌的發生率高達0.05%以上，是世界上高發病地區之一，每年約20萬人死于該種疾病，且發生率呈逐年升高的趨勢[8]。現階段對于食管癌的病因尚不明確，認為由多種因素引起的食管鱗狀或腺狀上皮的持續性病變，最終都可能發展為食管癌。研究顯示，食管癌的5年存活率低于45%，中位存活時間不到32個月，病死率較高，易出現發和轉移，遠期預后效果較差[9]。因此，探索食管癌的發病機制，尋找有效生物學分子標志物，可為食管癌的臨床靶向治療和預后判斷提供新思路。

表3 食管癌患者腫瘤組織中miR-217、環狀-TTBK2表達情況與臨床病理特征之間關系

圖2 不同miR-217、環狀-TTBK2表達食管癌患者3年總生存率的比較

表4 影響食管癌患者預后單因素COX回歸分析結果

項目HR95% CIPmiR-217表達3.5761.237～10.3380.000環狀-TTBK2表達3.8541.569～9.4670.000年齡1.6150.577～4.5200.251性別1.7340.491～6.1240.134病理類型1.2480.679～2.2940.616浸潤深度1.9761.109～3.5210.043腫瘤分化2.5471.011～6.4170.035淋巴結轉移3.0391.348～6.8510.015TNM分期3.6431.914～6.9340.000

表5 影響食管癌患者預后多因素COX回歸分析結果

微小RNA(microRNA，miRNA)含有18～25個核苷酸，是真核生物細胞內一類高度保守的內源性單鏈非編碼RNA，能與靶基因mRNA 3′非編碼區特異性結合，調節基因轉錄和表達，在細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等生理生化過程中發揮非常重要的作用[10]。Ansari等[11]發現，miR-93、miR-143在食管鱗狀細胞癌腫瘤組織中表達明顯降低，可作為食管鱗癌的潛在生物學標志物。Wang等[12]研究發現，miR-625在食管癌組織中表達下調，低表達miR-625可促進食管癌細胞增殖、遷移，過表達miR-625則抑制食管癌細胞增殖、遷移，提示miR-761有望作為食管癌的治療靶點。Winther等[13]研究表明，miR-21在食管鱗癌和食管腺癌腫瘤組織中表達上調，miR-21高表達與食管鱗癌和食管腺癌患者的疾病特異性、生存率和總生存率較差有關，是影響患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-21有望作為評價食管癌患者預后情況的生物學標志物。以上研究表明miRNAs在食管癌發生、發展過程中具有抑癌或致癌作用，可作為食管癌的潛在預后生物學標志物和治療靶點，然而miR-217在食管癌發生、發展過程中的作用尚不清楚。

miR-217是哺乳動物常見的miRNA之一，存在于多種細胞、組織中。Su等[14]發現，miR-217在轉移性肝癌組織和高侵襲性肝細胞癌細胞系MHCC-97H細胞中的表達較低，過表達miR-217抑制MHCC-97H細胞侵襲能力，表明miR-217可能作為潛在的腫瘤抑制因子參與肝細胞癌的疾病進展。Lin等[15]分析發現，miR-217在甲狀腺癌組織和細胞系中表達下降，與患者臨床分期、淋巴結轉移情況有關，細胞實驗表明，過表達miR-217可顯著抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，同時可抑制體內腫瘤的生長，提示miR-217作為抑癌因子參與甲狀腺癌的發展。Zhang等[16]發現miR-217在結腸癌組織中表達顯著高于癌旁組織，與結腸癌患者的臨床分期及總體生存率有關，過表達miR-217 可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，推測miR-217可能作為致癌因子參與結腸癌的發生。以上研究結果顯示，miR-217在惡性腫瘤發展和進展中既可作為抑癌基因也可作為致癌基因發揮作用。

本研究對69例食管癌腫瘤組織及對應癌旁組織進行檢測，發現食管癌組織中miR-217表達水平顯著降低，與miR-217等在肝細胞癌、甲狀腺癌中的表達模式一致[14,15]。提示miR-217在食管癌中可能作為抑癌基因發揮作用。本研究中miR-217表達與食管癌患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，隨著患者TNM分期的升高、分化程度的降低，腫瘤組織中miR-217表達水平逐漸升高，有淋巴結轉移的患者腫瘤組織中miR-217表達水平高于未轉移患者。其中TNM分期和病理分化可反腫瘤的分化程度，分期分級越高，分化程度越差，腫瘤的惡性程度越高，提示miR-217低表達參與食管癌疾病的進展，與腫瘤惡性程度有關。進一步分析發現，miR-217低表達者3年存活率顯著低于miR-217高表達者，提示miR-217低表達與食管癌患者3年存活率有關，影響患者的預后，推測miR-217可作為反應食管癌惡性程度和患者預后的生物學標志物。

環狀RNAs是一類不編碼蛋白質的ncRNAs，大多數環狀RNA都來自外顯子區域，且多數分布于細胞質中。近期研究表明，環狀RNAs在胃癌、結腸癌等消化系統腫瘤中異常表達，參與惡性腫瘤的發生，逐漸作為一種新型生物學標志物應用于癌癥疾病的篩查[17，18]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一種激酶，可催化Tau蛋白和微管蛋白磷酸化而激活[19]。Bender等[20]發現，線性TTBK2過表達與腎癌細胞系和黑色素瘤細胞系的耐藥性密切相關。Zheng等[21]報道稱，在膠質瘤組織和細胞系中均發現環狀-TTBK2表達顯著上調，而線性-TTBK2表達無顯著變化，體外實驗進一步發現，過表達環狀-TTBK2促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，敲除環狀-TTBK2則可導致體內腫瘤的回歸，提示環狀-TTBK2高表達促進膠質瘤進展。

本研究發現，食管癌腫瘤組織中環狀-TTBK2表達水平顯著升高，與Zheng等[21]在膠質瘤中發現一致，提示環狀-TTBK2 在食管癌發生過程中可能作為致癌基因發揮作用。本研究中環狀-TTBK2表達與食管癌患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，隨著患者TNM分期的升高、分化程度的降低，腫瘤組織中miR-217表達水平逐漸升高，提示環狀-TTBK2 高表達可能參與食管癌疾病進展。進一步分析發現，環狀-TTBK2高表達者3年存活率顯著低于環狀-TTBK2低表達者，提示環狀-TTBK2高表達與食管癌患者的生存率有關，影響患者的預后，推測環狀-TTBK2可能作為判斷食管癌患者疾病程度和預后情況的生物學標志物。本研究采用COX比例風險模型對影響食管癌患者預后的危險因素進行分析，結果顯示，miR-217表達、環狀-TTBK2表達、TNM分期是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，提示檢測食管癌腫瘤組織miR-217、環狀-TTBK2表達情況可評估患者預后情況。另外，Pearson分析表明，食管癌腫瘤組織中miR-217與環狀-TTBK2表達呈負相關，表明二者某種方式相互作用，然而具體以何種方式共同參與調節食管癌的發生和進展仍不明確，將在進一步研究中進行探索。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-217在食管癌患者腫瘤組織中低表達，環狀-TTBK2高表達，二者表達與患者TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移及3年存活率有關，是影響食管癌患者預后的獨立危險因素，推測二者可能作為治療食管癌的潛在靶標，并用于判斷患者預后。