miR-802和RAB23在食管鱗癌中的表達水平及臨床意義

蔣慶鋒 程金華 申思寧 程紀偉 邢文群

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)主要發生于食管內且向鱗狀上皮分化形成的一種惡性腫瘤，常發生于生理性或病理性狹窄處，具有較高發生率及預后差等特性[1]。目前腫瘤診斷及治療水平的提高，但食管鱗癌的治療及預后無明顯改善。研究表明食管鱗癌的發生與原癌基因、抑癌基因等有關[2]。miRNA(microRNA)是一類內源性非編碼RNA分子且在腫瘤發生、發展中發揮抑癌或促癌的作用，研究表明miR-802可在舌鱗狀細胞癌中抑制腫瘤細胞的增殖及分化[3]。研究證實RAB23在胃癌組織中上調表達并促進腫瘤細胞的侵襲及遷移[4]。目前關于miR-802與RAB23在食管鱗癌中的研究相對較少，因此本研究主要探討食管鱗癌組織中miR-802與RAB23表達水平并探究二者是否具有相關性及其臨床意義。

資料與方法

1.一般資料:收集120例筆者醫院病理科2014年3月～2015年2月期間進行食管鱗癌切除手術的標本為食管鱗癌組，另選取癌旁正常組織為對照組，所有患者均經病理證實為食管鱗狀癌。食管鱗癌組120例，其中男性57例，女性63例，患者年齡45～70歲，平均年齡59.25±6.56歲。正常組120例，其中男性53例，女性67例，患者年齡47～72歲，平均年齡60.86±5.15歲。收集兩組臨床病理資料，包括腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期、組織分化程度、浸潤程度等。按照食管癌TNM分期標準分為Ⅰ期19例，Ⅱ期22例、Ⅲ期48例、Ⅳ期31例[5]。根據評估組織分化程度：高分化 28例、中分化 51例、低分化 41例[6]。納入標準：①食管鱗癌癌患者均經手術病理證實；②未進行化學治療或放射治療者；③病灶無明顯壞死區；④患者知情且簽署同意書。排除標準：①自身免疫性疾病者；②具有明顯炎性細胞浸潤癌旁組織；③嚴重腎臟損傷者；④臨床資料不全者。兩組臨床資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.研究方法：(1)采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法食管鱗狀細胞組織中miR-802與RAB23 mRNA相對表達量：取出超低溫冰箱內保存的食管鱗狀細胞組織樣本，利用Trizol(北京恩碩科技有限公司)提取組織總RNA，按照反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟將2μgRNA反轉錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix試劑(北京恩碩科技有限公司)說明配反應體系并加樣。其中miR-802以U6為內參基因，RAB23以GADPH為內參基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物設計詳見表1。qRT-PCR反應體系共為20μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μl，cDNA 2μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，ddH2O 6μl。每個樣品設置3個生物學重復，完成后將其放入熒光定量PCR儀上進行反應，程序設定為：95℃1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，共42個循環，72℃延伸10min。反應結束后收集數據，并對所得數據Ct值進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-802與RAB23 mRNA的相對表達量。(2)免疫組化法檢測食管鱗狀細胞組織中RAB23蛋白表達:食管鱗狀細胞組織用石蠟包埋制作石蠟切片并經二甲苯脫蠟，將其在不同梯度(100%、95%、80%、70%)乙醇中脫水后置于檸檬酸鹽溶液中1min，PBS(0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液)清洗后并滴加3%H2O2室溫下反應30min，PBS清洗3次且每次清洗時間為5min，清洗后加入山羊抗兔血清反應60min，反應后滴加稀釋后(1∶200)的RAB23一抗，放入4℃冰箱過夜，次日取出切片并用PBS清洗3次， 加入抗辣根過氧化物酶標記的二抗，置于37℃溫箱孵育1h，PBS清洗后加入DAB(二氨基聯苯氨)顯色液進行顯色反應，蒸餾水清洗后采用蘇木素復染，經蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5s后清洗，用中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。

表1 qRT-PCR引物序列

3.結果判定:從每個切片中選取5個高倍視野(×400)中隨機挑選并對陽性染色細胞數量進行統計[7]。觀察并記錄兩項指標：陽性細胞百分比與染色程度。按照染色程度：無色0分；淡黃色1分；棕褐色2分。按照陽性細胞百分比：<10%記為0分；10%～25%記為1分；26%～50%記為2分；>50%記為3分。取兩組計分之乘積：0分為陰性，≥1分為陽性。

4.隨訪:通過打電話或復診的方式對所有患者均進行3年隨訪，并統計無生存進展期(PFS)即患者開始治療到腫瘤進展或死亡這一段時間與總體生存時間(OS)即從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間。

結 果

1.兩組miR-802與RAB23 mRNA表達水平的檢測結果:兩組miR-802、RAB23 mRNA水平存在明顯差異，食管鱗癌組患者miR-802表達水平低于正常組，而RAB23 mRNA表達水平高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表2。

表2 兩組miR-802、RAB23 mRNA表達量檢測結果

與正常組比較，*P<0.05

2.食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達情況:免疫組化組顯示RAB23在細胞核中表達，染色呈淡黃黃色、棕褐色，詳見圖1。與正常組比較，食管鱗癌組RAB23蛋白陽性表達增強，差異有統計學意義(t=17.342,P<0.05)，詳見表3。

圖1 食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達情況(免疫組化，×400)A.RAB23陰性表達;B.RAB23陽性表達

表3 食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達

組別nRAB23陰性陽性陽性率(%)正常組120784235.00食管鱗癌組120348671.67

3.miR-802、RAB23表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系:根據miR-802檢測結果的中位值將其分為高表達組共42例，低表達組共78例，觀察miR-802、RAB23表達與食管鱗癌患者臨床病理參數的關系，結果顯示miR-802與組織分化程度、TNM分期、浸潤程度相關，RAB23與淋巴結轉移、TNM分期及組織分化程度相關，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表4。

4.食管鱗癌組織中miR-802與RAB23表達水平的相關性分析:Pearson相關性分析miR-802與RAB23表達水平的相關性，結果顯示miR-802與RAB23呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖2。

5.食管鱗癌組織中miR-802、RAB23表達與患者預后的關系：Kaplan-Meier曲線顯示，miR-802、RAB23均與患者PFS、OS密切相關。miR-802高表達組PFS、OS(77.03%、69.25%)均高于低表達組(19.44%、22.41%)，RAB23陰性表達組PFS、OS(76.97%、63.94%)均高于陽性表達組(23.19%、20.28%)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖3、圖4。

討 論

食管癌是一種消化系統常見的惡性腫瘤且具有較高發生率，但其發病機制尚未完全清楚，而食管鱗癌是食管癌的主要類型且患者預后差[8]。食管鱗癌確診時已處于中、晚期且已出現腫瘤細胞轉移及浸潤而降低患者生存率，目前臨床常采用手術與放射治療、化學治療結合的方式進行治療，但不敏感患者治療效果不明顯。隨著現代科技的進步，癌癥依靠分子標志物進行診斷已取得較好的臨床治療效果，但對食管鱗癌分子標志物的研究相對較少，因而尋求用于早期檢測食管鱗癌及其預后的分子標志物具有重要指導意義。miRNA是一類內源性非編碼小RNA分子并可參與調控轉錄后基因表達的過程，已有研究表明，miRNA可通過調控下游基因的表達進而參與腫瘤形成、轉移及代謝過程[9]。近來研究發現大量miRNA可在食管鱗癌中發揮促癌或抑癌的功能并可用于臨床診斷或評估預后[10]。因此，探究食管鱗癌組織中miRNA的表達對于研究食管鱗癌的發生、發展具有十分重要的意義。

表4 食管鱗癌組織中miR-802、RAB23表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

圖2 miR-802與RAB23表達水平的相關性分析

圖3 食管鱗癌患者miR-802表達與PFS、OS的關系A.PFS曲線;B.OS曲線

圖4 食管鱗癌患者RAB23表達與PFS、OS的關系A.PFS曲線;B.OS曲線

miR-802位于人類21染色體上，研究表明miR-802與多種惡性腫瘤發生、發展有關[11]。miR-802可通過調控靶基因FoxM1表達而抑制乳腺癌細胞增殖及遷移[12]。研究表明miR-802在前列腺癌組織中過表達時可通過調控Flot-2表達進而抑制癌細胞中EMT的遷移及侵襲，miR-802可能為抑癌基因[13]。目前關于miR-802在食管鱗癌組織中的表達研究相對較少，本研究通過qRT-PCR法檢測食管鱗癌組織及癌旁組織中miR-802表達量，結果顯示食管鱗癌組中miR-802表達顯著低于正常組，說明食管鱗癌組織中miR-802呈下調表達，且miR-802參與食管鱗癌發生、發展過程。根據miR-802檢測結果的中位值分為高表達組與低表達組，并觀察其與患者臨床病理參數的關系，結果顯示miR-802與組織分化程度、TNM分期、浸潤程度顯著相關，且TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期時miR-802高表達比率較高而Ⅲ～Ⅳ期時miR-802呈顯著低表達趨勢，說明miR-802在食管鱗癌的進展及轉移過程中呈低表達并可能發揮抑癌基因的作用。同時本研究對miR-802表達與食管鱗癌的預后關系進行研究，Kaplan-Meier曲線顯示miR-802高表達組PFS、OS均顯著高于低表達組，說明miR-802低表達與食管鱗癌患者預后不良有關，推測miR-802表達與食管鱗癌發生、發展有關并可作為判斷疾病進展及評估患者預后的分子標志物。

RAB23位于人類染色體6p12.1是一種小GTP酶且屬于致癌基因，研究表明RAB23是多種惡性腫瘤的靶點，上游基因調控RAB23表達并可發揮腫瘤啟動子的作用[14]。相關研究表明RAB23可通過整合素β1/Rac1途徑進而促進鱗狀細胞的癌細胞發生遷移與侵襲[15]。乳腺癌細胞中RAB23可上調表達且與乳腺癌細胞增殖及轉移緊密相關。Bin等[16]研究表明胃癌組織中RAB23上調表達且可參與胃癌細胞系Hs746T及SGC7901的侵襲及轉移過程。關于RAB23在食管鱗癌組織中的表達水平研究相對較少，因而本研究通過qRT-PCR法檢測RAB23在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達水平，結果顯示研究組患者RAB23 mRNA表達水平顯著高于對照組，且免疫組化結果顯示食管鱗癌組中RAB23蛋白陽性表達顯著高于對照組，說明食管鱗癌組織中RAB23呈高表達，RAB23表達與食管鱗癌的發生、發展有關。

臨床病理參數分析結果顯示，RAB23與淋巴結轉移、TNM分期及組織分化程度顯著相關，TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期時RAB23陰性表達率較高，而Ⅲ～Ⅳ期時RAB23陽性表達率較高，說明隨著淋巴結的轉移、TNM分期變化及組織分化，食管鱗癌組織中RAB23表達隨之升高。Kaplan-Meier曲線顯示，RAB23陰性表達組PFS、OS均顯著高于陽性表達組，說明RAB23陽性表達與食管鱗癌患者預后緊密相關。推測RAB23可作為早期診斷及評估患者預后的輔助指標。研究表明miR-802可通過上調靶基因RAB23表達進而參與胃癌細胞的增殖及遷移[17]。本研究通過Pearson法對miR-802與RAB23進行相關性分析，結果顯示二者呈負相關，說明miR-802可通過調控靶基因RAB23的表達進而參與食管鱗癌發生及病情進展過程。本研究結果揭示miR-802、RAB23表達水平可判斷食管鱗癌患者的疾病嚴重程度，并對早期診斷及評估患者預后均具有重要參考價值。

綜上所述，食管鱗癌組織中miR-802下調表達，RAB23上調表達，二者呈負相關，且均與患者病情進展及預后有關，二者均可能為臨床早期判斷患者病情及評估預后的重要分子標志物。miR-802與RAB23是否為負調控模式及其內在機制有待進一步研究。