個體化補充葉酸對新生兒出生缺陷的影響

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浙江麗水市婦幼保健院婦產科浙江麗水

出生缺陷是指由于遺傳、環境、染色體或基因異常等因素造成胎兒或胚胎在生長發育過程中出現一系列諸如先天性心臟病、唇腭裂、無腦兒或者脊柱裂等結構和功能異常的疾病，其在我國的發生率高達5.6%[1-2]。由于出生缺陷的具體發病機制尚未得到明確，近年來越來越來資料顯示出生缺陷與基因多態性關系密切，葉酸代謝相關基因和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)則最為常見。由于甲硫氨酸合成還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)為葉酸代謝相關基因的關鍵酶，當MTRR及MTHFR的基因位點多態性改變時可顯著增加血清中Hcy的表達水平，目前臨床上普遍認為適當補充葉酸水平可顯著減少Hcy表達水平，在妊娠期婦女孕前及孕后3個月內則為最佳時機，可顯著減少出生缺陷的發生率[3-4]。然而關于葉酸的最佳補充劑量、作用機制尚未得到明確，因此本研究通過麗水市婦幼保健院婦產科2017年11月至2018年5月657例進行孕檢的孕婦作為研究對象分析不同葉酸代謝關鍵酶基因型及個體化補充葉酸對孕婦血清Hcy水平和出生缺陷發生的影響。

1研究對象與方法

1.1研究對象

將浙江麗水市婦幼保健院婦產科2017年11月至2018年5月657例進行孕檢的孕婦作為研究對象；年齡為20～35歲，平均為(26.79±3.45)歲。納入標準：①夫婦雙方均無家族遺傳性疾病；②夫婦雙方均無明顯解剖學異常；③夫婦雙方心肝腎功能均正常。

1.2方法

1.2.1分組情況

在首次孕檢時，對研究對象血清Hcy含量與MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位點情況進行測定。按照基因檢測結果，可將個體對葉酸利用能力風險等級進行劃分，分成高度風險、中度風險、低度風險及未發現風險共四等級[5]，見表1。其中，中高度風險共301例(A組)與低度風險+未發現風險共356例(B組)，評估未給予兩組孕婦葉酸處理時血清中Hcy的表達水平。其中，A組給予葉酸800μg/d，B組給予葉酸400μg/d，均至孕3個月。記錄兩組Hcy水平和新生兒出生缺陷情況。

表1葉酸利用能力基因檢測風險等級的劃分

Table 1 Division of risk level for gene detection of folic acid utilization

1.2.2標本采集及檢測

首次孕檢時均通過收集兩組孕婦的口腔粘膜上皮細胞并通過Taqman-MGB技術行基因檢測(MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T多態性)，其中基因檢測探針及試劑均由蘇州泰通基因檢測器械有限公司提供，通過PCR技術對MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T位點行熒光定量測定，其中每個反應體系總體積為10L，于95℃恒溫箱反應10min后采用PCR擴增儀于92℃恒溫箱反應15s及60℃恒溫箱反應60s行20個循環的擴增，后于89℃恒溫箱反應15s及60℃恒溫箱反應90s行30個循環的擴增。擴增結束后通過PCR擴增儀行熒光定量檢測讀取出終點熒光并通過相應的分析軟件明確各種樣本的基因分型。抽出兩組孕婦清晨空腹外周靜脈血5mL行Hcy表達水平檢測。于兩組孕婦處于12～13孕周時，再次抽取空腹外周靜脈血5mL行Hcy表達水平檢測，通過全自動生化分析儀并采用酶循環法檢測兩組孕婦血清中的Hcy的表達水平。

1.3統計學方法

2結果

2.1孕婦MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型結果

本研究納入的657例進行孕檢的孕婦的三種基因分型均行Hardy-Weinberg檢驗，結果均提示P>0.05，由此可大致將本樣本以代表本地區全部孕婦。657例進行孕檢的孕婦MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三種純合突變頻率分別為6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657),見表2。

表2孕婦MTRR A66G和MTHFR A1298C、C677T基因分型結果[n(%)]

Table 2 Genotyping results of MTRR A66G and MTHFR A1298C and C677T in pregnant women[n(%)]

基因基因型結果MTRR A66GAA385(58.60)AG230(35.01)GG42(6.39)MTHFR A1298CAA421(64.08)AC198(30.14)CC38(5.78)MTHFR C677TCC361(54.95)CT119(18.11)TT177(26.94)

2.2兩組孕婦補充葉酸前后Hcy表達水平的比較

統計結果顯示，個體化補充葉酸前，A組孕婦血清中Hcy的表達水平顯著高于B組(P<0.05)；個體化補充葉酸后，兩組孕婦血清中Hcy的表達水平提示無顯著差異(P>0.05)，見表3。

組別例數(n)補充前(μmol/L)補充后(μmol/L)A組30110.98±2.156.39±1.42B組3568.01±2.056.28±1.43t18.090.99P<0.010.33

2.3補充葉酸前所有孕婦Hcy對葉酸的利用能力ROC曲線分析

以中高度風險表示陽性，以低風險及未發現風險為陰性，繪制個體化補充葉酸前所有孕婦Hcy對葉酸利用能力的ROC曲線，結果顯示當血清中Hcy的表達水平超過8.55mol/L時，ROC曲線下面積為0.79，葉酸利用能力中重度風險的特異性及敏感度分別為78.09%、81.06%,見圖1。

圖1補充葉酸前所有孕婦Hcy對葉酸利用能力的ROC曲線

Fig.1 ROC curve of folic acid utilization of Hcy in pregnant women before folic acid supplementation

2.4兩組孕婦出生缺陷情況比較

兩組新生兒總出生缺陷率比較無顯著差異(P>0.05)，見表4。

表4 兩組孕婦出生缺陷情況比較[n(%)]

3討論

3.1造成高Hcy血癥的可能原因

已有文獻報道，高Hcy血癥是引發新生兒出生缺陷的獨立高危因素之一，這是由于Hcy具有較強的細胞毒性可直接影響胎兒的生長發育，造成胎兒畸形、生長發育緩慢甚至是胎死宮中等嚴重后果[6-7]。造成這樣的原因可能是：①血清中Hcy濃度增加使血管內皮細胞受損，同時刺激血小板的增殖，誘導血栓的形成，出現胎盤血管栓塞，從而阻斷胎盤幫助胎兒排出代謝產物或給予營養物質；②血清中Hcy濃度增加使機體內的氧自由基及過氧化物分泌升高，導致DNA受損及細胞凋亡；③血清中Hcy濃度增加降低S-腺苷蛋氨酸的分泌，引起DNA低甲基化，導致染色體出現減數不分離現象；④血清中Hcy濃度增加可間接引發神經干細胞凋亡，引起胎兒神經管閉合不全，出現先天性心臟病及神經管畸形的問題[8-9]。

3.2造成高Hcy血癥的直接原因

據相關研究報道，孕婦血清中的葉酸不足或相對不足是導致高Hcy血癥的一個直接原因[10]。其中，MTRR、MTHFR為葉酸代謝相關基因的關鍵酶，當這二者出現基因多態性是可顯著減少機體內的酶活性，引起血清中的Hcy無法向蛋氨酸內轉化出現DNA低甲基化，同時大量的Hcy積聚于血清中，從而出現高Hcy血癥。目前臨床上主要采用補充葉酸以控制高Hcy血癥，其中圍孕期(妊娠期婦女孕前及孕后3個月)適量補充葉酸能有效防治出生缺陷已經得到廣泛的認可。然而，有文獻指出，在不同人群或者不同地區使用補充葉酸以降低高Hcy血癥的臨床療效相差較遠[11]。據相關研究顯示，C677基因中的TT純合型突變可顯著降低酶的活性，可降低至30%，而CT雜合型突變則可使酶的活性減少35%[12]。本研究發現，657例進行孕檢的孕婦MTRR A66G基因型GG、MTHFR A1298C基因型CC、C677T基因型TT三種純合突變頻率分別為6.39%(42/657)、5.78%(38/657)、26.94%(177/657)，且具有明顯的地域差異，其中我國北方地區TT突變基因顯著高于南方地區，與相關參考文獻相一致[13]。由此可推測，MTHFR造成的區域分布差異與補充葉酸后預防出生缺陷的效果不一致相關。此結果也很好解釋神經管畸形好發于我國北方地區的一定原因。

3.3個性化葉酸治療高Hcy血癥的意義

本研究按照基因測定結果，分為A組(301例)與B組(356例)。其中，A組給予葉酸400g/d，B組給予葉酸800g/d，均至孕3個月，結果發現個體化補充葉酸前，A組孕婦血清中Hcy的表達水平顯著高于B組；個體化補充葉酸后，兩組孕婦血清中Hcy的表達水平提示無顯著差異；兩組新生兒出生缺陷提示無顯著差異。有文獻認為，給予高Hcy血癥婦女大劑量的葉酸治療雖可以控制高Hcy血癥，但大劑量的葉酸也會提高婦女排卵的次數，出現多胎妊娠的風險，而且大劑量的葉酸會造成脂類代謝紊亂，導致血糖濃度劇增，提高血脈粥樣硬化的發生率[14]。因而本研究認為臨床上應該根據患者具體的葉酸利用能力制定個性化的給藥方法，降低大劑量葉酸服用帶來的毒副作用，提高臨床療效。同時本研究以中高度風險表示陽性，以低風險及未發現風險為陰性作出補充葉酸前個體化補充葉酸前所有孕婦Hcy對葉酸的利用能力ROC曲線，結果顯示當血清中Hcy的表達水平超過8.55mol/L時，提示葉酸利用能力中重度風險的特異性及敏感度分別為78.09%、81.06%。可見對于基層醫院采用Hcy以評估葉酸的利用能力并指導治療具有深刻的意義。

綜上所述，不同葉酸代謝關鍵酶基因型及孕婦血清Hcy檢測有利于為不同孕婦提供個體化補充葉酸治療，減少出生缺陷的發生率。但本研究尚存在一定不足，如未能檢測葉酸水平變化及膳食調查，文中僅采用Hcy作為單一評估指標，而對反映葉酸代謝及正常值水平的多項指標仍需今后進一步拓展。