豬產氣巴氏桿菌廣東株的分離鑒定及其16S rDNA 基因序列遺傳進化分析

陳勝男，翟頎，李墾科，張杰，鐘汝情，陳曉倩，謝瑩，焦思思，冉承峰，翟少倫**，鄒育根**

（1.廣州中科基因檢測服務有限公司，廣州 510500；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室 農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640）

1974 年，美國科研人員從豬體內分離到一種類產氣巴氏桿菌[1]。之后，這種細菌在加拿大、法國、捷克、比利時、丹麥、匈牙利、英格蘭等多個國家發現報道，由于其生化特征相似，都呈現氧化酶和尿素酶陽性，還可以分解多種糖類產氣，故而命名為產氣巴氏桿菌（Pasteurella aerogenes）[2-7]。分類學上，產氣巴氏桿菌是巴氏桿菌科（Pasteurella family）巴氏桿菌屬（Pasteurella genus）的成員。臨床上，多項研究表明其可與人和多種動物的流產、死胎、脊椎炎等密切相關[8-12]。

本研究從廣東某豬場母豬產道分泌物中分離到一株革蘭氏陰性小球桿菌，經16S rDNA 核苷酸序列比對分析鑒定為豬產氣巴氏桿菌，并對分離株的藥物敏感性、16S rDNA 遺傳進化進行分析。具體報告如下：

1 病例描述

廣東某豬場存欄母豬350 頭，自2018 年6 月-11 月，一直出現母豬屢配不孕、流產等情況。為了弄清楚母豬繁殖障礙的原因，采集6 份母豬產道分泌物，待檢。

2 細菌分離

6 份母豬產道分泌物分別接種血平板，經24 小時增菌培養，血平板上均出現1 種菌落，不溶血。經革蘭氏染色，該菌呈現鏈狀的小球菌（圖1），命名為GD01 株。

3 藥敏試驗

采用藥敏紙片法評估該菌的藥物敏感情況，結果顯示該菌對丁胺卡那霉素、恩諾沙星、阿莫西林克拉維酸鉀、羧芐西林和新霉素高度敏感，對氨芐西林、慶大霉素、多西環素、卡那霉素和妥布霉素中度敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、青霉素、四環素和復方新諾明低度敏感，而對林可霉素、大觀霉素、鏈霉素、磺胺異噁唑和甲氧芐氨嘧啶表現耐藥。

4 16S rDNA 序列擴增、克隆與分析

采 用 細 菌 1 6 S r D N A 通 用 引 物 (F:5’-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3’; R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)組建PCR 擴增16S rDNA 核酸序列，具體反應條件如下：95℃預變性5min，30 個循環（95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s），72℃再延伸7min。經PCR擴增，電泳分析顯示，1%瓊脂糖凝膠出現約1500bp 大小的目的片段(圖2)。對片段進行克隆測序，獲得1465bp 的核酸序列。在線Blastn 分析顯示GD01 株與我國云南的豬產氣巴氏桿菌菌株（ZY14013，GenBank 號：KM555273）同源性最高，達99.8%。由于GenBank 中產氣巴氏桿菌16S rDNA 核酸序列長短不一，本文截取了相同區域的序列進行比對分析，結果顯示GD01 株與瑞士的豬源產氣巴氏桿菌（JF2011 株，GenBank 號：AF139577）同源性最高（99.9%），與美國的豬源產氣巴氏桿菌（P-172-71 株，GenBank 號：NR_026032）同源性最低（98.5%）（圖3）。在遺傳進化樹上，也可看出GD01 株與產氣巴氏桿菌在同一分支，而與副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）332 株（GenBank號：AB370297）和麥氏巴氏桿菌（Pasteurella mairii）34310-72株（GenBank 號：AB370297）遺傳關系較遠（圖4）。

5 討論與小結

2014 年，我國首例豬產氣巴氏桿菌感染病例是在云南省流產母豬群中報道，盡管分離株對小鼠有一定的致病性，豬樣品中豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2 型、豬偽狂犬病毒、衣原體陰性，但其是否是引起豬流產的主要病原仍然未知[13]。本研究也在廣東流產豬群中，分離到豬產氣巴氏桿菌，所采集樣本中豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2 型、豬偽狂犬病毒也是陰性。這進一步驗證了豬產氣巴氏桿菌是引起豬流產的重要潛在病原。亟需開展懷孕母豬群中的動物感染實驗，來評定其致病性。█