單增李斯特標準菌ＮｒｄＤ基因插入突變株的構建

舒加樂 鄭琳琳

摘要：利用同源重組的原理構建了單增李斯特氏菌NrdD基因插入突變株，從大腸桿菌基因組中分別擴增出NrdD基因上下游同源臂，與pKSV7質粒相連，構建成功重組突變載體pKSV7-D1D2，將其電轉入單增李斯特菌后，用氯霉素抗性平板篩選得到NrdD基因插入突變株，并對突變菌株序列測定，證明回復突變株構建成功。該突變株可在嚴格無氧環境中生存，為進一步研究NrdD基因功能、單增李斯特的致病機制和疫苗載體的研發奠定了基礎。

關鍵詞：單增李斯特菌;NrdD基因;突變株;同源重組

中圖分類號：R392.11? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2019）05-0005-02

李斯特菌病是由單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）引起的一種人獸共患病，能夠引起人、羊、豬等動物疾病。人感染后能引發腦膜炎、發熱性敗血性胃腸炎等臨床癥狀，感染后發病死亡率約為25%。單增李斯特氏菌為一種革蘭氏陽性、兼性厭氧胞內寄生菌，但無法在嚴格的無氧條件下生長，廣泛寄生于肉類、蛋類、海產品、乳制品和蔬菜細胞內，己被世界衛生組織列為四大食源性致病菌之一[1]。因此研制預防李斯特菌病的疫苗迫在眉睫。但因其特殊的寄生定殖方式導致其疫苗的開發比較緩慢，構建能在動物腸道等無氧環境中生存的突變菌株可作為減毒細菌疫苗載體，給研制口服疫苗提供重要的基礎，這對動物疫病的預防和控制有重要意義。

NrdD基因是大腸桿菌在厭氧環境中高度表達的一種基因，現已被證實能夠調節細菌在無氧環境中的代謝途徑[2]。有報道稱LM的標準株EGD-e基因組中無NrdD基因，因此在腸道內的存活率不高，導致其滯留時間短，不能快速有效地產生免疫反應[3]。

LM作為致死率極高的胞內寄生菌，能經受高溫烹飪、胃部強酸環境等逆境后隨食物到達腸道。隨后LM通過內化作用進入腸道上皮細胞或吞噬細胞，在宿主細胞內和細胞間進行增殖，再隨淋巴系統和血液循環系統到達胎盤和大腦，引起孕婦流產或腦膜炎、敗血癥等臨床癥狀，嚴重的可造成肝和脾的膿腫以及局部壞死。LM獨特的致病機制使其具備了作為疫苗載體的優秀潛質[4]。如果將單增李斯特菌做減毒處理，將其作為載體轉入腫瘤抗原等制成的腫瘤疫苗，就可以起到激發細胞免疫特異殺傷腫瘤細胞的作用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株與質粒? 單增李斯特菌減毒株LM1003（以EGD-e為模板）;穿梭載體pKSV7;克隆載體pMD18-T。

1.1.2? 主要試劑? rTaq DNA聚合酶、dNTP等;基因組DNA提取試劑盒，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，質粒抽提試劑盒，限制性內切酶SalI，BamHI，T4 DNA連接酶;氨芐青霉素，氯霉素，卡那霉素;BHI培養基。

1.1.3? 引物及測序? 引物根據NCBI序列（ID：948755）設計（表1）。

1.2? 方法

1.2.1? 質粒構建? 將減毒株LM1003（actA/plcB雙缺失）菌落接種于BHI液體培養基中，37 ℃搖床振蕩培養16 h。取5 mL菌液離心后提取LM1003全基因組。取2μL基因組DNA為模板，擴增NrdD基因上下游序列。將擴增得到的兩個片段進行酶切，連接后，轉入克隆載體pMD-18T中。將連接產物pMD-18T-D1、pMD-18T-D2轉入DH5α感受態細胞中，在含氨芐青霉素的LB平板生長即表示轉入成功，并用PCR驗證。

1.2.2? 重組質粒pKSV7-D1D2的構建? 從驗證后的pMD-18T-D1D2質粒中擴增D1D2片段，基因片段回收后，分別將D1D2片段和pKSV7穿梭載體質粒雙酶切，連接后轉入DH5α感受態細胞中，涂氨芐青霉素抗性平板，進行PCR鑒定后送公司測序。

1.2.3? 電轉? 將重組穿梭質粒pKSV7-ΔD1D2電轉到單增李斯特菌中，涂在含氯霉素的BHI平板上，置于30 ℃培養箱中培養至平板上長出單菌落。

1.2.4? NrdD插入突變菌株的篩選? 挑取氯霉素平板上的單菌落接種于BHI培養基中培養，做菌液PCR鑒定。將陽性菌落接種于BHI培養基中傳代，每12 h傳代1次。含氯霉素抗性的37 ℃傳5代，無抗性的41 ℃傳5代，將末次傳代菌液進行平板劃線（含氯霉素）篩選1代，挑取平板上的單菌落接種于37 ℃無抗性傳5代，41 ℃無抗性傳5代，將末次傳代菌液進行平板劃線（含氯霉素）篩選1代，以使基因發生同源重組，將末次培養產物進行氯霉素抗性板劃線和無抗性板劃線培養，得到在抗性板上不生長在無抗性板上生長的單菌落，即為疑似NrdD插入突變菌株，最終通過PCR和序列測定驗證NrdD是否插入突變成功。

1.2.5? NrdD回復菌株的鑒定-細菌RNA的抽提和RT-PCR? 將LM1003和LM1025單個菌落接種于BHI液體培養基中培養過夜后收集于1.5 mL離心管中。提取RNA，RT-PCR檢測NrdD基因是否成功表達。

2? 結果與分析

2.1? 插入突變菌株的構建及篩選

將構建好的pKSV7-D1D2重組載體電轉入單增李斯特菌LM1003后，將含有重組載體的菌落進行氯霉素和溫度篩選。菌落PCR鑒定結果見圖1。

2.2? pKSV7-D1D2序列驗證

將陽性的pKSV7-D1D2克隆重新接種含有氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃培養過夜，抽提質粒，取10 μL質粒測序。圖2為在NCBI序列對比圖，圖3為峰圖。確認pKSV7-D1D2序列正確。

3? 小結與討論

基因敲除不僅是研究基因功能的重要分子生物學手段，也是制備減毒疫苗的重要策略之一，對毒力基因的敲除可以大大加快減毒疫苗的研發速度。本研究構建了既能在大腸艾希氏菌表達又能在單增李斯特菌表達的穿梭載體質粒，利用生物體內的同源重組及抗生素抗性和溫度篩選得到了單增李斯特菌的NrdD基因插入突變菌株，并且通過PCR和序列測定驗證NrdD插入突變成功，為基因功能的研究和減毒疫苗的研發奠定了一定的基礎。

參考文獻：

[1] 李云霞，陳雯雯，顧晨榮，等.單增李斯特菌的檢測方法研究進展[J].上海師范大學學報（自然科學版），2015（6）：687-693.

[2] SUN X，HARDER J，KROOK M，et al.A possible glycine radical in anaerobic ribonucleotide reductase from Escherichia coli：nucleotide sequence of the cloned nrdD gene[J].National academy of sciences，1993，90（2）：577-581.

[3] OFER A，KREFT J，LOGAN D T，et al.Implications of the inability of Listeria monocytogenes EGD-e to grow anaerobically due to a deletion in the class III NrdD ribonucleotide reductase for its use as a model laboratory strain.[J].Journal of bacteriology，2011，193（12）：2931-2940.

[4] 周? 云，潘? 蕾，郝春秋，等.單增李斯特菌作為疫苗載體的研究進展[J].中國免疫學雜志，2011（12）：1132-1134.