彝族“黃藥”艾納香中黃酮的提取工藝優(yōu)選研究

杜麗潔 黃火強(qiáng) 張亞琛

【摘 要】 目的：優(yōu)選艾納香中總黃酮的提取工藝。方法：以乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。結(jié)果：最佳條件為用16倍量的50%乙醇，提取3次，每次1.5h。結(jié)論：優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、合理，可用于艾納香中總黃酮的提取。

【關(guān)鍵詞】 艾納香;總黃酮;正交試驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）1-0027-04

Abstract：Objective To optimize the extraction process of total flavonoids from Huang Yao（Blumea balsamifera DC.）of Yi Nationality.Methods With the concentration of ethanol， extraction time， ratio of material to liquid and extraction times as the factors， the extraction rate of total flavonoids was used as the index， and the extraction process was optimized by orthogonal test. Results The optimal conditions were as follows： 16 times the amount of 50% ethanol， extracted 3 times， each time 1.5h. Conclusion? The preferred process is stable and reasonable and can be used for the extraction of total flavonoids from Ayurveda.

Keywords： Blumea Balsamifera DC.; Total Flavonoids;Orthogonal Test

彝族“黃藥”的中藥名為艾納香，又稱為大風(fēng)艾、牛耳艾、大骨風(fēng)、冰片艾等，為菊科艾納香屬植物艾納香（BLumea baLsamifera DC.）全草[1]，主要分布在云南、貴州、廣西、廣東等地[2]。艾納香最早記載于公元741年陳藏器所編著的《本草拾遺》：“主癬避蛇”，由于療效確切，在歷代本草等相關(guān)文獻(xiàn)中均有關(guān)于艾納香用途、用法及療效等方面的記載[3]。艾納香以其全草或地上部分入藥，其性味苦、溫、辛，主要有祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、消腫止痛等功效[4]。彝醫(yī)認(rèn)為其性味苦，入脾、肺氣路，有清熱解毒、逐瘀化痰的功效，在中國(guó)西南彝族地區(qū)被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤，尤以抗肺癌效果為佳[5]。

文獻(xiàn)報(bào)道，艾納香的主要成分為黃酮和揮發(fā)油，同時(shí)也含有少量的苷類成分，其中黃酮類成分的研究最為廣泛。目前報(bào)道的黃酮類物質(zhì)主要為黃酮（醇）類、二氫黃酮類和查爾酮類三大類[6-10]。其藥理作用也主要集中在黃酮類物質(zhì)的作用上，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。為合理利用彝族“黃藥”艾納香植物中的黃酮類化合物，需要優(yōu)化對(duì)其進(jìn)行最大化提取分離的方法。目前已有學(xué)者對(duì)“黃藥”艾納香的總黃酮提取工藝和含量測(cè)定進(jìn)行了考察，黃永林等[14]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，對(duì)艾納香葉、小枝條、莖中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示葉中總黃酮含量最高為2.94%，小枝條含量最低只有1.21%。羅夫來(lái)等[15]用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量，以提取率為指標(biāo)，用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)選艾納香最佳提取工藝。和銀霞等[16]用超聲波提取方法考察了艾納香的提取工藝，并測(cè)定不同部位總黃酮的含量。課題組前期研究結(jié)果[17]表明，艾納香的黃酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在羅夫來(lái)等[15]研究基礎(chǔ)上考察了提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響，并利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選取乙酸乙酯萃取部位對(duì)彝族“黃藥”艾納香中總黃酮進(jìn)行考察，以期找到最佳的提取工藝，為更好地開(kāi)發(fā)利用艾納香并發(fā)揮其藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AdventurerOHAUS電子天平，UV1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海鳳凰光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材 “黃藥”為菊科艾納香屬植物艾納香的干燥莖、葉，購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)DNA條形碼鑒定為真品。

1.3 試劑 蘆丁對(duì)照品（北京百靈威科技有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。

2 方法

2.1 艾納香中總黃酮測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品15.1mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密 吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、4、6、8mL，分別置于25mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min;10% AL（NO3）3溶液1mL，搖勻，放置6min;4% NaOH溶液10mL，搖勻，靜置15min，加水至相應(yīng)刻度。在510nm處測(cè)定各溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明蘆丁在0.00604～0.04832mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材2.0g，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇按不同的料液比、不同的加熱時(shí)間以及不同加熱次數(shù)進(jìn)行回流提取，濾過(guò)，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液（濃度為1mg/mL）待用。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 稱取艾納香藥材2.0g，用80%的乙醇按料液比為15∶1加熱回流3次，每次3h，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液待用。精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下處理，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算吸光度RSD值為0.515%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批艾納香藥材5份，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，其余的步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，結(jié)果吸光度值得RSD值為1.035%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，其余步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法加顯色劑顯色進(jìn)行處理，分別在0、5、10、15、20、25、30min測(cè)定其吸光度值，計(jì)算RSD值為0.5627%，樣品在30min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批艾納香藥材1.0g，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密量取5份2mL供試品溶液置于25mL容量瓶中，分別加入0.151mg/mL的蘆丁對(duì)照品2mL，其余的步驟按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，結(jié)果平均回收率為97.3%，RSD值為0.753%。

2.1.8 總黃酮的測(cè)定 取艾納香藥材按“2.1.3”制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，測(cè)定吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算總黃酮的含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 對(duì)乙醇濃度設(shè)5個(gè)濃度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密稱取艾納香全草2.0g，置于100mL三角瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇 40mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2h，提取液過(guò)濾，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計(jì)算總黃酮含量和提取率。

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度小于 50% 時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率程增加趨勢(shì); 當(dāng)乙醇濃度為 50% 時(shí)，總黃酮提取率最高; 此后，再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，因此，確定乙醇濃度為 50% 左右較為合適。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 考察提取時(shí)間的影響，設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度，即0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h。精密稱取2.0g艾納香全草，置于100mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40mL，70 ℃ 水浴回流至規(guī)定時(shí)間，提取液過(guò)濾，共提取3次，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計(jì)算總黃酮含量和提取率。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間小于1.5h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率程增加趨勢(shì);當(dāng)提取時(shí)間為1.5h左右時(shí)，總黃酮提取率最高;此后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，總黃酮提取率反而略微下降。因此，確定提取時(shí)間為1.5h左右較為合適。

2.3 因素水平的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)研究選取影響艾納香回流提取的乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時(shí)間（D）為考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)表篩選最佳工藝。見(jiàn)表1。

2.4 正交試驗(yàn) 取艾納香藥材2g，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行提取，濾過(guò)，減壓濃縮得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，濃縮凍干成干粉。稱取相應(yīng)質(zhì)量的萃取物粉末，配置成供試品溶液，測(cè)定其吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算艾納香總黃酮百分含量。以該結(jié)果列入正交設(shè)計(jì)表中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取3份艾納香藥材各2g，按照上述優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的測(cè)定方法條件測(cè)定，計(jì)算艾納香藥材中總黃酮提取率。結(jié)果艾納香藥材中總黃酮的提取率分別為2.74%、2.81%、2.77%，平均值為2.77%，RSD值為1.27%。結(jié)果表明所選工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

測(cè)定黃酮含量目前最常用的方法是紫外-可見(jiàn)光分光光度法（比色法），是被測(cè)物質(zhì)在適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后，在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的測(cè)定吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，從而對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法[18]。總黃酮含量的測(cè)定往往采用蘆丁作對(duì)照品，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后，在510nm處測(cè)定吸光度值[14]。

實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)總黃酮提取率影響量較大的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)為4個(gè)主要因數(shù)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化艾納香的總黃酮提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取次數(shù)對(duì)艾納香中總黃酮的提取影響最大，其次為乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比。最終優(yōu)選的工藝條件為采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5h。該工藝驗(yàn)證，3次提取結(jié)果的總黃酮提取率RSD值為2.0%，說(shuō)明該工藝重復(fù)性良好，且總黃酮提取量最大，因此確定為最佳提取條件，為后續(xù)的艾納香研究實(shí)驗(yàn)作為參考。隨著臨床研究的進(jìn)一步發(fā)展，艾納香中總黃酮的藥理作用及作用機(jī)制將進(jìn)一步被闡釋說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝將對(duì)彝族“黃藥”艾納香的深度開(kāi)發(fā)利用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-11-14 編輯：陶希睿）