三種麻醉藥對 C57BL/6 雄性小鼠體表心電圖的影響

彭薪元，劉 燕，夏天嬌，丁 潔，徐力致

(南京大學醫學院，南京 210023)

由于哺乳動物的基本生命過程具有的共性特征使得醫學實驗中探索生命過程的反應可以部分利用實驗動物來替代。然而，不同種屬的動物又存在各自的生理特點，其對藥效學、藥代動力學、毒性等各項反應存在差異，因此只有熟悉并掌握動物的這些差異，才能獲得真實的動物實驗結果[1]，并將其有效的運用于人類疾病的替代研究中。

心電圖描記在生物及醫學實驗研究中是一種常用的方法。然而由于動物大多數無法配合檢測，強制性束縛又會導致心電觀察不準，因此多數情況下動物是在麻醉狀態下進行心電觀測[2]。這就需要考慮不同麻醉藥由于其作用機制不同，動物對其反應性所產生的差別[3]，以防止由于麻醉藥物的本底影響而導致的實驗偏差甚至錯誤。

本課題組在前期的實驗研究中關注到，部分麻醉藥作用的小鼠心電波形與麻醉時長存在一定的相關性。因此設計了本實驗，以C57BL/6雄性成年小鼠為試驗對象，探討了三種常見動物麻醉藥對小鼠心電圖的影響，探尋對小鼠心電干擾因素較低的麻醉藥及恰當的數據采集時間，以期為環境安全、生命科學及醫學研究中涉及小鼠心電圖的初步觀察提供一定的參考依據，降低因麻醉藥使用或觀測時間點的選取不當造成的實驗失敗。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性成年小鼠24只，10～12周齡，體重25～32 g，小鼠購自南京大學模式動物研究所[SCXK(蘇)2015-0001]，按照標準操作規程飼養于清潔級ICV動物房中[SYXK(蘇)2014-0052]， 自然光照、恒溫20℃ ～ 22℃、恒濕60% ～ 70%，自由飲用無菌去離子水，喂養SPF級小鼠維持型飼料(江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司)。所有動物實驗符合南京大學醫學院附屬鼓樓醫院實驗動物倫理委員會要求。

1.2 主要試劑與儀器

RM6240多道生理信號采集處理系統(成都儀器廠)，銀針型電極，氨基甲酸乙酯(化學純，批號：20150123)，水合氯醛(分析純，批號：20170309)購自國藥集團化學試劑有限公司，戊巴比妥鈉(分析純，批號：3G223G27)購自生興生物技術有限公司。藥品均使用上海百特醫療用品有限公司購買的0.9%氯化鈉溶液(批號：S1610052)進行配置。氨基甲酸乙酯與0.9%氯化鈉溶液比例為0.2 g/mL配置成20%的氨基甲酸乙酯溶液；水合氯醛與0.9%氯化鈉溶液比例為0.025 g/mL配置成2.5%的水合氯醛溶液；戊巴比妥鈉與0.9%氯化鈉溶液比例為0.01 g/mL配置成1%的戊巴比妥鈉溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

所有小鼠隨機分配為三組，每組8只，分別為： 20%氨基甲酸乙酯組、2.5%水合氯醛組、1%戊巴比妥鈉組。

1.3.2 麻醉

所有小鼠實驗前禁食12 h。麻醉方式采用腹腔注射麻醉。20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，劑量為7 mL/kg； 2.5%水合氯醛溶液麻醉，劑量為3 mL/kg； 1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，劑量為10 mL/kg。等待小鼠出現四肢無力，對皮膚疼痛反應消失，判斷小鼠已經麻醉完全。

1.3.3 小鼠心電圖描記

在干凈、光線柔和、無噪音的實驗室中，打開 RM6240E多道生理信號采集處理系統及計算機。

將小鼠以仰臥位置于38℃(小鼠正常體溫)保溫實驗臺上將3 根銀針電極分別插入小鼠腳踝皮下，注意針頭與電極的連接須十分緊, 針頭切勿插入肌肉(以防出現肌電波)。選擇II導聯(按照右上肢綠色，左下肢紅色，右下肢黑色的順序，連入 RM6240E多道生理信號采集處理系統，參數設定：掃描速度為40 ms/div，靈敏度為500 μV，連續記1 h的心電圖數據，進行統計分析。

RM6240E多道生理信號采集處理系統連續記錄心電波形，從初始記錄開始，每隔 5 min 讀取心率一次，每次記錄時間為 10 s；每隔 10 min讀取一次 PR間期，QRS群寬度，P波振幅，選擇每個時間段中基線平穩的連續5個心搏，分別取其平均值為該時段相應參數測量值。

1.4 統計學處理

用Prism統計軟件對各項指標進行處理，組間比較用t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同麻醉藥作用小鼠心電圖波形表現

三種不同麻醉藥作用于小鼠連續觀察1 h，比較初始心電圖波形與40 min后波形改變情況，由表1可發現，水合氯醛組心電圖波形變化主要表現為間期隨時間延長；戊巴比妥鈉組呈現出兩種主要波形，4只表現為S波較深型，4只變現為S波較淺型，且兩種波形均表現為間期隨時間延長；氨基甲酸乙酯組在初始時的心電圖與40 min時的心電圖波形基本一致，無明顯變化。

表1 三種麻醉藥作用下心電圖波形變化情況Table 1 Changes in ECG of C57BL/6 mice by three anesthetics

表2 不同麻醉藥對小鼠心率的影響Table 2 Effect of different anesthetics on heart rate in the C57BL/6 mice

注：與麻醉初始比較(0 min)，aP<0.05,bP<0.01。

Note. Compared with 0 min，aP<0.05,bP<0.01.

2.2 不同麻醉藥對小鼠心率的影響

表2顯示，氨基甲酸乙酯組的平均心率明顯高于水合氯醛組和戊巴比妥鈉組(P<0.01)，并且維持在這一高水平。水合氯醛組和戊巴比妥鈉組小鼠的心率隨時間延長均表現為受到抑制。與初始值(0 min)相比，戊巴比妥鈉組在10 min～20 min存在心率明顯降低(P<0.01),其后逐漸趨于穩定；水合氯醛組在15 min左右心率明顯降低(P<0.01)，隨后心率逐漸趨于平穩。

2.3 不同麻醉藥對心電圖PR間期的影響

氨基甲酸乙酯組在實驗全程PR間期基本不變，水合氯醛組以及戊巴比妥鈉組PR間期延長(圖1)。

注：與麻醉初始比較(0 min)，aP<0.05,b P <0.01。圖1 不同麻醉劑對小鼠PR間期的影響Note. Compared with 0 min， a P <0.05,b P <0.01.Figure 1 Effect of different anesthetics on the PR interval in the EGG of C57BL/6 mice

2.4 不同麻醉劑對小鼠QRS群寬度的影響

戊巴比妥鈉組QRS寬度明顯增長，水合氯醛組和氨基甲酸乙酯組QRS群寬度無明顯變化(P>0.05)(圖2)。

圖2 不同麻醉劑對小鼠QRS群寬度的影響Figure 2 Effect of different anesthetics on QRS duration in the EGG of C57BL/6 mice

2.5 不同麻醉劑對心電圖P波振幅的影響

水合氯醛組P波振幅無明顯變化，戊巴比妥鈉組10 min時有抬高，但無統計學意義(P>0.05)。氨基甲酸乙酯組振幅不隨時間有明顯變化。(圖3)

圖3 不同麻醉劑對小鼠P波振幅的影響Figure 3 Effect of different anesthetics on the P-wave amplitude in C57BL/6 mice

3 討論

實驗動物學在現代生命科學和醫學研究中起著重要作用，伴隨著人類文明的進步，人們也同樣關注動物生存福利。科學研究者們依循 “減少(reduction)、替代(replacement)、優化(refinement)”的“3R”原則，除了在動物進行有創實驗前必須實施有效麻醉[4]，減輕動物由實驗造成的痛苦外，還應注重優化實驗，在確保實驗數據的真實有效情況下，盡量減少實驗動物的使用量。對于實驗進行細致的優化處理，不僅符合當今倫理學要求，更可以保障一些較難重復的實驗(譬如環境污染對機體造成的慢性復雜性疾病發生)可以同步獲得較多的初期指標(諸如血常規、心功能、肺功能等)，以利于進一步機制的深入探索。

常用動物麻醉藥有戊巴比妥鈉，水合氯醛，氨基甲酸乙酯，氯胺酮等[5-6]，或者使用兩種或兩種以上麻醉藥比如甲苯噻嗪與氯胺酮組合對動物復合麻醉[7]。由于麻醉藥物的濃度和劑量選擇在不同研究中較為復雜，尤其在心電圖觀察中，劑量過多容易造成心電基線不穩。同時麻醉藥本身還存在藥品不同批號存在藥效差異。研究人員根據文獻報道[8-11]及本實驗室過往經驗，利用少量小鼠(2～4只/組)進行了初步預實驗，最終確定20%氨基甲酸乙酯7 mL/kg劑量、2.5%的水合氯醛溶液3 mL/kg劑量和1%戊巴比妥鈉溶液10 mL/kg劑量均可獲得基線穩定的心電圖波形。

本研究顯示給予20%氨基甲酸乙酯后對小鼠心率前后的影響不明顯，而2.5%水合氯醛和1%戊巴比妥鈉對小鼠的心率均有一定的抑制作用，這一結果與文獻報道一致[12]。

水合氯醛對心臟表現為非迷走神經效應和迷走神經效應雙重作用。非迷走神經效應是對心臟代謝的抑制；而迷走神經效應表現為心動徐緩。本研究顯示2.5%水合氯醛對小鼠的心率有抑制作用，引起PR間期延長，這與心率的變化對應。QRS波寬度未觀察到明顯變化，同時對于P波振幅沒有明顯影響。同時發現2.5%水合氯醛注射20 min后小鼠心電趨于平穩，有報道顯示臨床口服水合氯醛作為先天性心臟病患兒心臟彩超檢查鎮靜劑[13]，可見其對心臟各項功能影響不大。

本研究發現1%戊巴比妥鈉腹腔注射給藥后，小鼠心率降低、PR間期，QRS波寬度和 QT 間期均明顯延長。有研究指出戊巴比妥鈉可延緩房室結-希蒲系統傳導，延長心室除極和復極時間，并抑制竇房結自律性[14]，且隨麻醉時間延長而加重。這與本實驗中所觀察到1%戊巴比妥鈉引起C57BL/6小鼠QRS波群增寬以及P波振幅下降的現象相符。QRS波群寬度反映的是心室除極和復極的時間，而P波作為心房除極的反映，其電位一部分是由竇房結的動作電位組成，竇房結受到抑制可影響P波振幅。此外戊巴比妥鈉作用下，小鼠心電表現較不規律，有文獻報到戊巴比妥鈉可用于心衰模型的建立[15]，制造急性心功能不全。

本研究中20%氨基甲酸乙酯對小鼠的心率及各波形組份均無較大影響，與之前文獻報道的結果相一致[12]。研究發現在氨基甲酸乙酯麻醉狀態下，交感神經系統和副交感神經系統對于維持心血管活動仍起張力性作用[16]。因此多數學者認為氨基甲酸乙酯較其它麻醉藥對各種心血管反射有更好的保護作用。但是，此作用可能掩蓋心血管藥物對心肌的基礎生理反應，在研究中需加以注意。

“動物麻醉藥是動物臨床上的一類重要藥品，各類動物的個性化需求增大，臨床應用廣泛；但由于其特殊性，需要嚴格的監管，臨床應用上出現一些困擾，常常出現無法購買到正規藥品，或者無藥可用的尷尬局面[17]”。而水合氯醛是一類價格低廉、容易獲得的正規藥品。同時必須指出，水合氯醛作用于中樞神經產生麻醉效果僅為催眠作用，并不具有鎮痛作用。此外，腹腔注射水合氯醛與大鼠腸梗阻、腹膜炎和胃潰瘍有關，因此不推薦通過腹腔注射進行存活手術[18]。美國獸醫協會(AVMA)目前已不推薦水合氯醛用于動物的麻醉及安樂死。因此，國內的研究者在其研究中往往考慮折中的方式進行相關研究，即：僅需其催眠鎮靜作用進行的相關研究(不涉及手術等創傷)，且不作為存活實驗的前期麻醉藥。譬如本文的心電圖測量以及一些影像學研究，并在進行有效觀察后，終止動物生存。

綜上所述，20%氨基甲酸乙酯對小鼠心電前后影響不大，但始終處于高心率狀態。1%戊巴比妥鈉與2.5%水合氯醛均抑制小鼠心率，使PR間期，QRS波寬度明顯延長。且水合氯醛在注射20 min后小鼠心電各波形變化趨于平穩。因此，在進行科學研究過程中，選擇水合氯醛進行麻醉時，最好在麻醉20 min后再進行相應數據測量，以減少麻醉藥自身帶來的干擾。

最后還應指出，不同麻醉藥甚至同一麻醉藥的不同給藥劑量，對于同一種屬不同年齡階段的動物均可造成較大差異[19]，只有做出精細的實驗設計，才能真正獲得安全、可靠的實驗數據，才能完成動物實驗真實的價值。