太子參環(huán)肽提取物對ＬＱＩＳ－ＣＯＰＤ大鼠動物模型的干預作用

楊晗 闞永軍 曾潔

【摘要】目的：考察太子參環(huán)肽提取物對肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干預作用。方法：采用煙熏+木瓜酶蛋白制備肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydiseaseoflung-qiinsufficiencysyndrome，LQIS-COPD）大鼠模型，太子參環(huán)肽提取物高、中、低劑量（100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d），灌胃給藥30d;測定大鼠的氣道阻力和肺動態(tài)順應性。結果：LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，咳嗽、氣急、喘鳴的癥狀明顯改善，顯著降低模型大鼠的肺氣道阻力，增加其肺動態(tài)順應性。結論：太子參環(huán)肽提取物對LQIS-COPD有良好的干預作用。

【關鍵詞】太子參;環(huán)肽提取物;LQIS-COPD;干預作用

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0025-03

慢性阻塞性肺疾病（ChronicObstructivePulmonanyDisease，COPD），是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的疾病，與肺部對香煙、霧霾等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關[1]。COPD屬于中醫(yī)“喘證”、“肺脹”等范疇。病情長期反復于緩解和急性發(fā)作之間，日益加重。中醫(yī)藥防治有悠久歷史，各醫(yī)家多以祛邪和補虛相結合的方法治療。急則治標，急性發(fā)作期多以祛邪為主;緩則治本，穩(wěn)定期補虛，或攻補兼施。無論是在COPD急性期還是穩(wěn)定期，不僅止咳化痰平喘，還進行全身整體調節(jié)，中醫(yī)藥或中西醫(yī)結合均有著很好的療效，且副作用小[2-3]。

肺氣虛是COPD的始動因素，并貫穿于整個病程。對氣虛的治療是COPD穩(wěn)定期的重要中醫(yī)治療策略[4];肺氣虛的改善，可以有效減輕癥狀和減緩肺功能下降趨勢，對于多發(fā)、難治、具有反復發(fā)作特點的肺系疾病的綜合防治有積極作用[5]。太子參為石竹科植物孩兒參（Pseudostellariaheterophylla（Miq.）PaxexPaxetHoffm.）的塊根。既能益氣，又可養(yǎng)陰，適用于脾肺虧虛氣陰不足者。以清補潤燥見長，在中醫(yī)治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病中，為治療肺氣虛的核心藥物，使用頻次很高[6]。

太子參中所含化學成分種類繁多。其中，太子參環(huán)肽是由十多個氨基酸脫水縮合形成的環(huán)狀化合物，不僅具有能夠形成限制性構像的特點，而且其抗化學降解和抗酶解的能力在生物體內也強于線性肽，是一類有特色化學結構的成分[7]，但活性并不明確。制備液相色譜能夠實現在線檢測，具有高效分離的特點，其自動化的程度比較高，操作簡單，所得產品純度較高，在中藥制備分離方面得到了廣泛的應用[8]。本文利用制備型高效液相制備分離環(huán)肽提取物，從肺氣虛證（Lung-qiInsufficiencySyndrome，LQIS）入手，探討太子參環(huán)肽提取物對COPD的干預作用，以活性為導向，發(fā)現太子參中藥效物質。

1儀器與材料

1.1儀器ShimazuLC-8A型制備液相色譜儀（Japan），Waterse2695液相色譜儀，HypersilBDSC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱、C18制備型液相色譜柱;Medlab生理信號采集處理系統(tǒng)（南京美易有限公司），超聲霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械有限公司），生理體積描記盒（南京美易科技有限公司），呼吸流量計（北京新航興業(yè)科貿有限公司）;MOKULYOD-230型冷凍干燥器;BARNSTEADTⅡ型超純水機（美國Thermo公司）。

1.2材料太子參[Pseudostellariaheterophylla（Miq.）PaxexPaxetHoffm.]，購于福建柘參種業(yè)有限公司，經檢驗符合藥典標準。

SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，上海斯萊克實驗動物有限公司出品。

色譜純試劑：甲醇（德國Merck公司），乙腈（美國Fisher公司）;分析純試劑均為國藥集團化學試劑有限公司出品，水為電阻率為18.2Ω的超純水。

2方法結果

2.1太子參環(huán)肽提取物制備稱取干燥一定重量的太子參藥材粉碎至20目，以10倍乙酸乙酯為溶劑，采用索氏提取法提取2次，每次3h，過濾合并濾液，于旋轉蒸發(fā)儀上減壓回收乙酸乙酯，獲得干浸膏。取太子參乙酸乙酯干浸膏，以甲醇溶解，按本項目組專利方法進行高壓制備色譜環(huán)肽提取物分離，采用制備型液相色譜柱、采用紫外檢測器，檢測波長為205nm;以乙腈—磷酸溶液進行梯度洗脫，自動餾分收集器收集餾分[9]。按如下方法檢視提取物特征。

2.2環(huán)肽的檢識

2.2.1薄層鑒別按文獻方法[10]，取兩塊25mm×50mm的硅膠板G（板1和板2），將樣品分別點在兩塊板上，用氯仿-甲醇（9∶[KG-*3/5]1）展開揮掉溶劑后，板1放置，而板2懸于底部加有約1mL濃鹽酸的密閉的磨口玻璃缸中（耐酸和耐高溫玻璃缸），置于已升溫至110℃的烘箱中，加熱水解1～2h，冷卻后取出板2，在通風柜中揮掉鹽酸然后將未經水解的板1和加熱酸水解的板2同時噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風加熱幾分鐘即可顯色。用上述方法重復操作一次，根據兩次實驗結果，板2在多數情況下顯示幾個紫紅色斑點，少數情況下顯示某些黃色斑點，而板1在相應位置上無顯色斑點，由此提示樣品含有環(huán)肽或肽酰胺成分。

取50mm×50mm硅膠G板（板3），按照雙向薄層層析板點樣方法將樣品點在板上，用氯仿-甲醇（9∶[KG-*3/5]1）作第一向展開揮掉溶劑后，先按前述方法濃鹽酸高溫水解冷卻揮掉鹽酸后，然后在溶劑系統(tǒng)A（氯仿-甲醇-冰醋酸，8∶2∶2滴）進行第二向展開。揮掉溶劑后，板3噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風加熱幾分鐘斑點即顯出，按照上述方法再重復操作一次，板3在第二向的同一軸上顯示多個紫紅色或黃色斑點，確定樣品中含有環(huán)肽成分。

2.2.2代表性環(huán)肽波譜數據太子參環(huán)肽A，[M+H]+m/z728.4346，分子式C37H57N7O8，摩爾質量727.4269，二級質譜（MS/MS）特征碎片離子m/z分別為728.4354、710.4245、610.2519、310.2149、197.1280;太子參環(huán)肽B，[M+H]+m/z779.4434，分子摩爾質量778.4378，分子式C40H58N8O8，二級質譜（MS/MS）特征碎片離子m/z分別為779.4467、751.4508、405.2494。

2.3藥理學實驗

2.3.1動物造模本實驗采用《中醫(yī)實驗動物學》之“肺氣虛證”動物模型制備方法，并復合木瓜蛋白酶霧化吸入，復制“LQIS-COPD”模型大鼠。正常組（空白對照）置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng);大鼠暴露于1m3煙室中，用刨花/鋸末30g，香煙每支燃約10min，連續(xù)3支;另加SO2粉10g，點燃煙熏;每日2次，每次1h，并于造模開始后第30、32、34、36天將超聲波霧化器與40cm×40cm×40cm透明塑料箱相連，通過霧化管向箱中模型大鼠噴入0.3%的木瓜蛋白酶，每5只大鼠2mL，造模期60d。

2.3.2分組給藥Wistar大鼠隨機分組，每組10只。空白對照組、模型對照組造模結束后開始用生理鹽水灌胃10mL/kg·d，同時霧化吸入生理鹽水4mL/d;陽性對照組，灌服桂龍咳喘膠囊：每天用藥劑量1.25mL/100g，以含生藥0.09g/mL的藥液灌服;治療組，太子參環(huán)肽提取物高、中、低劑量（100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d），灌胃給藥模型大鼠30d。

2.3.3統(tǒng)計分析采用SPSS15.0軟件，數據以均值（x±s）的形式表示，二組間的比較用t檢驗，二個以上組間的比較用ANOVA/Holm-Sidak統(tǒng)計軟件處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2.4實驗結果

2.4.1模型大鼠一般狀況大鼠出現咳嗽、氣急、喘鳴、精神萎靡、行動遲緩、蜷伏不動、毛失光澤等癥狀，檢測一秒用力呼氣容積（FEV1）和用力呼氣量（FEV），FEV1/FVC<70%、30%

2.4.2大鼠肺功能測試灌胃給藥結束第2天，以25%烏拉坦（4mL/kg相當于1000mg/kg）將大鼠麻醉后，切開頸部皮膚，分離氣管，行氣管插管。壓力換能器、呼吸流量計連接Medlab生物信號系統(tǒng)測出潮氣量、氣道流速、跨肺壓，經數據處理得到肺氣道阻力（RL）和動態(tài)肺順應性（Cdyn）。LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，實驗結果見表1。

3結論

LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，LQIS-COPD大鼠咳嗽、氣急、喘鳴的癥狀明顯改善。

模型組大鼠RL較空白對照組增加了40.10%，而Cdyn則下降了75.14%;桂龍咳喘膠囊陽性對照組，較模型組RL下降了25.99%，Cdyn增加了140.40%。太子參環(huán)肽提取物400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg低、中、高劑量組，RL分別下降了24.01%、25.25%、26.98%，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05～0.01）;而Cdyn則分別增加了168.98%、170.83%%、171.30%，與模型組比差異較具有顯著統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。結果表明太子參環(huán)肽提取物高中低劑量均能明顯降低LQIS-COPD大鼠的肺氣道阻力，而顯著增加其肺動態(tài)順應性，太子參環(huán)肽提取物對肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病模型大鼠具有良好的干預作用。

4討論

COPD是一種常見疾病，吸煙或被動吸煙是引發(fā)該疾病十分重要的因素。氣道阻力及氣流受限是COPD的發(fā)展進程中的主要特征，氣道阻力的增加會導致肺內殘留氣體過多，從而引發(fā)肺和胸廓的順應性下降及呼吸功能障礙。本研究采用了RL及Cdyn兩個指標，判定太子參環(huán)肽提取物對LQIS-COPD的干預作用，其中RL反映了大鼠大氣道的氣流阻力情況，而Cdyn則反映了大鼠小氣道的氣流阻力及胸廓和肺組織的彈性狀況。研究結果顯示，太子參環(huán)肽提取物對煙熏+木瓜酶蛋白造模所產生的氣道阻力升高及肺部動態(tài)順應性降低具有顯著的抑制作用，從而證明了太子參環(huán)肽提取物對肺氣虛證LQIS-COPD模型大鼠的干預作用。

COPD疾病易長期反復發(fā)作，且久病難以治愈，從而損傷肺氣。肺主氣，司呼吸，控制一身之氣生成，肺氣虛損則肺失治節(jié)，則氣機不暢，宗氣不足，營衛(wèi)功能失調，從而外邪入侵，痞滿壅肺，引發(fā)咳嗽、肺脹、氣喘等現象。太子參補益肺氣具有潤肺止咳之功效，本文從肺氣虛證入手，探討太子參益氣養(yǎng)陰的藥理作用;以活性為導向，探索環(huán)肽類特色物質在太子參中所擔當的“活性角色”，對于進一步研究太子參的藥效物質基礎具有重要意義。

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