升麻對牙菌斑主要組成鏈球菌的體外抑菌活性研究

梁 婕 曾敏敏 鄭晨韻 陳深元 陳錫姣 楊雪瓊 龔道元 陳 鑫

佛山科學技術學院口腔醫藥工程學院，廣東省佛山市 528000

齲病和牙周病是人類常見的口腔疾病之一，齲病和牙周病發生的始動因子是牙菌斑。牙菌斑是附著于牙面、牙間或修復體表面的細菌性生物膜，容納了各種需氧菌、厭氧菌。人類牙菌斑中厭氧鏈球菌占大多數，其中變異鏈球菌、唾液鏈球菌、輕型鏈球菌和血鏈球菌在牙菌斑厭氧鏈球菌中占比較大，而變異鏈球菌更是致齲優勢菌。因此抑制牙菌斑主要組成鏈球菌有機會抑制牙菌斑的形成，從而有效預防齲病和牙周病[1]。

升麻作為一種傳統中藥，在臨床上常常被用于預防及治療口腔疾病，通過查閱有關的中醫古文記錄，也發現古人在治療口腔疾病過程中也使用了升麻這種中藥。升麻具有良好的抗炎鎮痛解毒作用，其成分含具有抗菌作用的乙酯[2]。中藥在我國來源豐富，副作用較小，尋找安全有效的防齲藥物是學者研究的熱點。

目前國內外針對中藥對口腔致病菌的研究很多，研究對象大部分主要為有明確抗菌作用的中藥[3-4]，而升麻作為一種可治療口腔疾病的傳統中藥，其對口腔致病菌作用的研究十分有限。根據有關升麻對口腔致病菌的最新研究進展，可確認升麻輔助五倍子等中藥的使用可對變異鏈球菌等有抑制作用。

因此本課題將研究升麻對4種牙菌斑主要組成鏈球菌的體外抑制活性，以期望可進一步的研究升麻是否具有抑制牙菌斑形成的活性，從而有效的預防齲病或牙周病。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、培養基及藥物:變異鏈球菌(Streptococcusmutans)ATCC25175、血鏈球菌(Streptococcussanguinis)ATCC49295、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)ATCC7073及乙型溶血鏈球菌(β-Hemolyticstreptococcus)CMCC32210均購于北納生物，BHI液體培養基購于；升麻購于佛山市北京同仁堂。

1.1.2 試劑及儀器：75%乙醇、厭氧袋、96孔板、恒溫培養箱、回流儀器、粉碎機、移液槍。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備：升麻于2017年11月于佛山北京同仁堂購入。將100g升麻粉碎，用藥重量6～14倍量體積的75%乙醇回流提取3次，每次回流2h，合并提取液，減壓濃縮成150ml的提取液[3]。取6管1ml的升麻提取液干燥后可得6管提取物，重量如表1。通過表1的數據計算可知升麻提取液的濃度約為13.5mg/ml,將提取液稀釋到10mg/ml作為抑菌試驗的母液。

表1 升麻提取液干燥后提取物重量

1.2.2 菌懸液的配制：將各菌株復蘇48h后，分別接種于BHI瓊脂培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養24h。取細菌接種于BHI液體培養基配成0.5麥氏單位的菌液(1.5×108/ml)，用BHI液體培養基稀釋1 000倍成試驗用的菌懸液。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定：采用微量肉湯稀釋法。取96孔板在每一排最左側標記4種鏈球菌的名稱，以一排為例，將從左往右數第11孔用作“BHI液體培養基+菌陽性對照”，標記為“+”，第12孔標記為“BHI液體培養基陰性對照”，標記為“-”。在第1孔加入升麻提取液(10mg/ml)200μl，在第2～12孔每孔均加入BHI液體培養基100μl。使用移液槍從第1孔中取100μl提取液至第2孔，混勻，依次進行到第10孔，棄去100μl混合液，達到倍比稀釋藥物提取液的目的，使1～10孔的藥物濃度分別為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml、0.039mg/ml、0.019 5mg/ml、0.001mg/ml。諸如此類，4種細菌使用4排孔進行試驗。每排的第1～11孔加入與各排標記的細菌名稱所對應的菌懸液100μl，最后將該96孔板置于37℃恒溫培養箱中培養18～24h，重復試驗3次，觀察現象，以肉眼所見微孔內能完全抑制細菌生長的最低藥物濃度即為該抗菌藥物對受試菌的MIC。

2 結果

升麻提取液對4種細菌的抑制活性。經過3次獨立重復試驗，測得4種牙菌斑主要組成鏈球菌對升麻提取液中的MIC及其平均值見表2；可看出升麻提取液對牙菌斑的幾種主要組成鏈球菌都有抑菌作用，其中對變異鏈球菌和唾液鏈球菌的抑制作用最為明顯，MIC可以達到0.2mg/ml左右，明顯優于對乙型溶血鏈球菌和血鏈球菌的作用，后兩者MIC均>1mg/ml。

表2 升麻對牙菌斑4種主要組成鏈球菌的最小抑菌濃度MIC(mg/ml)

3 討論

牙菌斑生物膜是齲病和牙周病的始動因子，而齲病和牙周病正是人類最普遍的兩種口腔疾病。本次研究的4種鏈球菌為牙菌斑生物膜種幾種常見鏈球菌，其中變異鏈球菌和血鏈球菌對維持牙菌斑的生態平衡有著非常重要的作用，變異鏈球菌通過產生胞外多糖粘附在光滑的牙面上，它的產酸性和耐酸性更使其成為重要的致齲菌[5]。乙型溶血性鏈球菌致病力強，常引起人類和動物的多種疾病。因此，以這4種鏈球菌作為研究針對抑制牙菌斑形成或防齲藥物的實驗菌種，具有實際意義。早期抗生素被用于預防或輔助治療齲病和牙周病，但長期使用抗生素可引起口腔菌群生態平衡失調，從而導致其他疾病。近年來研究發現，口腔細菌的耐藥性和細菌檢出率有逐年上升的趨勢[6]。故尋找毒副作用小的新藥物是非常必要的。非常多的中國傳統中草藥有清熱解毒、抑菌殺毒的作用，并且毒副作用小[7]。若能選出一種具有抑制這4種牙菌斑主要鏈球菌的中草藥，將可為延緩或抑制牙菌斑的形成提供一種重要方式。升麻具有清熱解毒、抗癌抗氧化的作用，升麻提取物具有較好的殺菌活性。升麻作為一種常用中草藥，自古以來便被用于治療口腔疾病。鄭雅楠[8]使用升麻提取物等制作了用于防治牙周病的口腔護理液。王記祥等[9]通過回流提取升麻根莖中的化合物進行抑菌實驗，發現其中25-O-乙酰升麻醇、興安升麻苷C和β-谷甾醇共3種化合物具有較好的抗菌活性。胡桂清、李建志等[4，7]發現升麻對金黃色葡萄球菌、埃希大腸桿菌等具有明顯抑菌作用。但有關升麻對口腔細菌的研究甚少，近幾年才開始開展研究，劉玉梅[10]發現五倍子和升麻配伍使用可抗齲病相關的口腔致病菌，胡小艷[11]發現升麻對牙齦卟啉單胞菌具有較強的抑制活性。可見升麻具有較好的抑菌特性，并且對某些口腔致病菌具有良好的抑制活性。本研究以升麻提取液作為實驗試劑，來對4種組成牙菌斑的鏈球菌的抑制活性，研究結果證實了升麻對變異鏈球菌和唾液鏈球菌有顯著的抑制作用，最小抑菌濃度可達0.21mg/ml；對血鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌有較好的抑菌濃度，最小抑菌濃度可達1.67mg/ml。升麻在我國應用廣泛，具有毒副作用小、資源豐富、成本不高等優點，本次研究結果表明升麻對4種牙菌斑主要組成的鏈球菌有良好的抑制活性，其作為防治齲病或牙周病的藥物具有巨大的開發潛力。但牙菌斑的形成是一個復雜的過程，齲病和牙周病也是多因素引起的疾病，僅僅研究藥物對某幾種特定的細菌的抑制活性并不能證明其具有作為藥物的價值。不同提取方法對升麻提取物的影響、長期使用升麻對口腔菌群生態平衡的影響，抑制這4種鏈球菌是否對牙菌斑的形成具有抑制作用，這些問題都需要再進一步的探索與研究。