心肌缺氧狀態下間充質干細胞對巨噬細胞M2極化的影響及其機制研究*

彭智勇，趙吉玲，張燁，余國龍

（中南大學湘雅醫院 心內科，湖南 長沙 410008）

目前已經明確單核細胞/巨噬細胞參與急性心肌梗死（以下簡稱心梗）炎癥反應、炎癥損傷、抗炎反應及組織修復的多重效應[1]。其主要通過M1 和M2型巨噬細胞發揮作用[2-4]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）是從骨髓中分離出來的成纖維細胞樣細胞，有研究證實MSC 移植治療急性心梗療效顯 著[5-6]。其主要作用機制并非心肌細胞再生，而是旁分泌機制對心梗炎癥心肌損傷、促心臟修復雙重效應的調節[7]。MSC 有促巨噬細胞M2 亞型極化的作用，體外MSC 對M2 亞型單核/巨噬細胞極化研究均非心肌細胞缺血、缺氧狀態下進行，且目前MSC 對巨噬細胞M2 極化機制缺乏相關報道。

1 材料及方法

1.1 材料及儀器

RAW264.7 小鼠M0 型巨噬細胞（中國科學院上海細胞生物學研究所），C57BL/6 小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），ST2825（美國MCE 公司），蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液及5-BrdU 均購自美國Sigma 公司，CD11c-PE、CD206-PE 及Flow Cytometry Staining Buffer 均購自美國eBioscience 公司，誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）-Alexa Fluor? 594（美國BioLegend 公司），精氨酸酶-1（Arginine 1,Arg-1）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、抗-iNOS抗體、抗-Liver Arginase 抗體[EPR6671（B）]、抗Toll樣受體2（Toll-like receptor 2,TLR2）抗體[EPR20303]、抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）抗體、抗-MyD88 抗體、抗-核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）、p65（phospho S536） 抗體、抗-IKK α+IKK β（phospho S180+S181） 抗體、抗-JNK1+JNK2（phospho T183+Y185） 抗體、抗-p38（phospho Y182）抗體、抗-ERK1（phospho T202）+ERK2（phospho T185） 抗體（EPR19401）、抗-β Actin 抗體（mAbcam 8226）-Loading Control（HRP）及山羊抗-兔IgG H&L（HRP）均購自英國Abcam 公司，電化學發光（Electrochemiluminescence,ECL）超敏發光液（美國Thermo 公司），Trizol（美國Invitrogen 公司），One Step SYBR? PrimeScript? RTPCR Kit 試劑盒（日本TaKaRa 公司），二氧化碳培養箱（美國Thermo Forma 公司），流式細胞儀（美國BD公司），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），冷凍高速離心機（美國貝克曼 公司）等。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞獲取、培養和鑒定 75%酒精消毒新生C57BL/6 小鼠皮膚，開胸取出心臟。根據夏機良等[8]方法獲取心肌細胞，將心肌細胞懸液均勻接種至6 孔板中，2 ml/孔，放入37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中。前48 h 需要在培養液中加入0.1 mm 5-Brdu，抑制成纖維細胞增殖。取培養7 d 細胞進行鑒定，心肌細胞形態呈梭形或多邊形，且免疫熒光染色后胞漿中可見清晰的a-SA 抗體染色的黃綠色肌絲。

1.2.2 無糖無氧（oxygen glucose deprivation,OGD）培養心肌細胞上清液 將心肌細胞培養基換作無糖培養基，持續高流速通入無氧氣體（95%氮氣N2+5%CO2）5 min 后，密封于罐中，置于培養箱中3 h，收集OGD 培養的心肌細胞上清液。

1.2.3 MSC 培養與鑒定 ①MSC 獲取、培養、鑒定：取6～8 周C57BL/6J 小鼠，脫頸處死，根據李魯生等[9]方法分離MSC，隔日換液，取P3 代細胞用于實驗。采用流式細胞儀檢測樣本，Flowjo 分析軟件進行數據分析。流式細胞儀檢測MSC 細胞表面標志物CD44、CD90 陽性率＞95%，CD11b、CD34 及CD45 陰性率＞95%，方可作為實驗細胞。②巨噬細胞培養：RAW264.7 小鼠M0 型巨噬細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱中，用含10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）高糖細胞培養基培養。每3 天用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞進行傳代，取對數生長期的細胞進行 實驗。

1.2.4 實驗分組及細胞處理 ①M0 組：將1×106個 RAW264.7 小鼠M0 型巨噬細胞接種于6 孔板中，常規培養24 h。②M0+OGD 組：將OGD 培養的心肌細胞上清液加入到6 孔板常規培養的RAW264.7 小鼠M0 巨噬細胞中，繼續培養24 h。③M0+OGD+MSC組：在M0+OGD 組基礎上，加入含10% 胎牛血清、DMEM/F12培養基的1×106個MSC，培養24 h。④M0+OGD+不同濃度髓樣分化因子88 組：在M0+OGD 組基礎上，分別加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖細胞培養基稀釋50、100 及200μmol/L 濃度的髓樣分化因子88 抑制劑，培養24 h 后分為M0+OGD+50μmol/L ST2825 組、M0+OGD+100μmol/L ST2825 組及M0+OGD+200μmol/L ST2825 組。

1.2.5 流式細胞術取0.25% 胰蛋白酶消化RAW264.7 巨噬細胞，1 000 r/min 離心5 min 收集細胞，Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細胞。計數并調整細胞濃度至1×107個/L。取100μl 細胞懸液加入2μl CD11c-PE、iNOS-Alexa Fluor? 488、Arg-1 偶 聯FITC 或CD206-PE 抗體。4℃避光孵育30 min。加入1 ml 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS），1 000 r/min 離心5 min，清洗細胞，加500μl PBS 重懸細胞上機檢測，利用Flowjo 軟件分析結果。

1.2.6 Western blotting 檢測 RIPA 裂解液裂解巨噬細胞，提取細胞總蛋白。采用蛋白定量試劑盒按說明書操作測巨噬細胞總蛋白濃度。等量蛋白以10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠120 V 電泳1 h，以350 mA 轉移至聚偏二氟乙烯膜，持續70 min。用含5%胎牛血清蛋白的TBST 溶液封閉1 h 后清洗2 或3 次。4℃環境下輕搖孵育抗iNOS、抗Arg-1、抗TLR2、抗TLR4、抗髓樣分化因子88、抗p65、IKKα/β、JNK1/JNK2、p38 及ERK1/2 一抗過夜。第2 天TBST 清洗2 或3 次后，室溫孵育山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗1 h。同時，孵育β-actin 抗體作為內參。采用ECL 超敏發光液顯色。

1.2.7 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR） 使 用Trizol提取巨噬 細胞總RNA。采用One Step SYBR? Prime Script? RT-PCR Kit 試劑盒逆轉錄合成cDNA 第一鏈并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內參，RT-PCR 檢測M1型巨噬細胞標志物TNF-α、iNOS 及IL-1β，M2 型巨噬細胞標志物IL-10、TGF-β1mRNA 水平。見表1。

表1 PT-PCR 引物序列

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 和GraphPad 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較用Bonferroni 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M0 組與M0+OGD 組M1、M2 型巨噬細胞比例比較

M0 組與M0+OGD 組M1 型巨噬細胞比例分別為（4.63±0.51）%和（40.77±2.26）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-27.008，P=0.001），M0+OGD 組高于M0 組。M0 組與M0+OGD 組M2 型巨噬細胞比例分別為（2.50±0.14）%和（2.38±0.18）%，經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.906，P=0.416）。見圖1。

圖1 M0 組與M0+OGD 組流式細胞圖

2.2 M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組M1、M2型巨噬細胞比例比較

M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組M1 型巨噬細胞比例分別為（68.47±2.67）%和（41.98±7.84）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.544，P=0.019），M0+OGD+MSC 組低于M0+OGD 組。M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組M2 型巨噬細胞比例分別為（9.80±0.64）%和（16.11±1.49）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-6.749，P=0.009），M0+OGD+MSC組高于M0+OGD 組。見圖2。

圖2 M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組流式細胞圖

2.3 M0+OGD 組 與M0+OGD+MSC 組iNOS、Arg-1 表達比較

Western blotting 檢測結果顯示，M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組M1 型巨噬細胞標記iNOS 相對表達量分別為（4.47±0.12）和（1.03±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=35.093，P=0.000），M0+OGD+MSC 組低于M0+OGD 組。M0+OGD 組 與M0+OGD+MSC 組M2 型巨噬細胞標記Arg-1相對表達量分別為（1.01±0.11）和（1.84±0.13），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-8.413，P=0.001），M0+OGD+MSC 組高于M0+OGD 組。見圖3。

2.4 M0+OGD 組與M0+OGD+MSC 組TNF-α、IL-1β、IL-10 及TGF-β1 mRNA 表達比較

圖3 iNOS 和Arg-1 蛋白的表達

RT-PCR檢測結果顯示，M0+OGD組與M0+OGD+MSC 組TNF-αmRNA 相對表達量分別為（2.33±0.70）和（0.97±0.12），IL-1βmRNA 相對表達量分別為（1.68±0.12）和（1.00±0.11），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.211 和-17.399，P=0.002 和0.000），M0+OGD+MSC 組低于M0+OGD 組。M0+OGD組與M0+OGD+MSC 組IL-10 mRNA 相對表達量分別為（1.0±0.17）和（1.77±0.19），TGF-β1mRNA 相對表達量分別為（1.0±0.54）和（1.43±0.18），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-5.249 和-3.967，P=0.006 和0.044），M0+OGD+MSC 組高于M0+OGD 組。見圖4。

圖4 各組TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1 mRNA 相對表達量比較

2.5 不同濃度髓樣分化因子88 抑制劑組M1、M2 型巨噬細胞比例比較

不同濃度髓樣分化因子88 抑制劑組M1 型巨噬細胞比例比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；M0+OGD 組高 于M0+OGD+50μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+50μmol/L ST2825 組高于M0+OGD+100μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+ OGD+100μmol/L ST2825 組高于M0+OGD+200μmol/L ST2825 組（P＜0.05）。不同濃度髓樣分化因子88 抑制 劑組M2 型巨噬細胞比例比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；M0+OGD 組低于M0+OGD+50μmol/LST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+ 50μmol/L ST2825 組低于M0+OGD+100μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+100μmol/L ST2825組低于M0+OGD+200μmol/L ST2825 組（P＜0.05）。見圖1和表2。

2.6 不同濃度髓樣分化因子88 抑制劑組iNOS、IL-10 mRNA 表達比較

不同濃度髓樣分化因子88 抑制劑組iNOS mRNA相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；M0+OGD 組高 于M0+OGD+50μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+50μmol/L ST2825 組 高于M0+OGD+100μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+ OGD+100μmol/L ST2825 組高于M0+OGD+200μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；不同濃度髓樣分化因子88 抑制劑 組IL-10 mRNA 相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；M0+OGD 組低于M0+ OGD+50μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+ 50μmol/L ST2825組低于M0+OGD+100μmol/L ST2825 組（P＜0.05）；M0+OGD+100μmol/L ST2825 組低于M0+OGD+200μmol/L ST2825 組（P＜0.05）。 見 表2和圖5。

2.7 各組TLR2、TLR4、髓樣分化因子88 及磷酸化蛋白相對表達量比較

各組TLR2、TLR4 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。M0 組低于M0+OGD 組 和M0+OGD+MSC 組，與M0+OGD 組高于M0+OGD+MSC 組（P＜0.05）。各組髓樣分化因子88 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。M0 組低于M0+OGD 組和M0+OGD+MSC 組，而M0+OGD 組高于M0+OGD+MSC 組（P＜0.05）。各組p-P65、p-IKKα/β、p-JNK1/2、p-P38 及p-ERK1/2 蛋 白 相 對 表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。M0 組低于M0+OGD 組和M0+OGD+MSC組，而M0+OGD 組高于M0+OGD+MSC 組（P＜0.05）。見表3和圖6。

表2 各組iNOS mRNA、IL-10 mRNA 及M1、M2 型巨噬細胞比例比較 （±s）

表2 各組iNOS mRNA、IL-10 mRNA 及M1、M2 型巨噬細胞比例比較 （±s）

組別 iNOS mRNA IL-10 mRNA M1/% M2/%M0 組 1.02±0.10 1.34±0.27 4.63±0.51 2.50±0.14 M0+OGD 組 15.6±1.47 1.00±0.36 40.77±2.26 2.38±0.18 M0+OGD+50μmol/L ST2825 組 11.5±1.21 2.43±0.93 29.39±1.83 4.73±0.39 M0+OGD+100μmol/L ST2825 組 8.34±1.14 3.57±0.20 17.10±0.89 7.24±0.30 M0+OGD+200μmol/L ST2825 組 5.59±0.63 7.13±0.29 9.75±0.67 14.0±0.59 F 值 87.317 432.208 326.988 547.400 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組iNOS mRNA、IL-10 mRNA 水平比較 （±s）

表3 各組TLR2、TLR4、髓樣分化因子88 及磷酸化蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組TLR2、TLR4、髓樣分化因子88 及磷酸化蛋白相對表達量比較 （±s）

組別 髓樣分化因子88 TLR2 TLR4 p-P65 p-IKKα/β p-JNK1/2 p-P38 p-ERK1/2 M0 組 1.00±0.12 1.01±0.92 1.02±0.18 1.00±0.31 1.00±0.09 1.00±0.04 1.00±0.20 1.00±0.08 M0+OGD 組 5.11±0.19 4.89±0.28 3.81±0.38 6.18±0.89 10.00±0.37 7.00±0.30 7.64±0.89 5.06±0.30 M0+OGD+MSC 組 3.19±0.48 2.91±0.60 2.73±0.33 4.68±0.61 6.64±0.45 5.13±0.63 4.85±0.53 3.06±0.42 F 值 134.221 75.158 61.692 54.715 531.534 89.982 133.017 171.899 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 各組TLR2、TLR4 和髓樣分化因子88 蛋白表達以及下游信號通路磷酸化水平

3 討論

MSC 促進心內巨噬細胞M1 向M2 亞型轉化效應近期得到初步肯定。2011年DAYAN 等[10]通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支復制心梗模型，對大鼠心梗后模型心肌注射MSC，與對照組相比，免疫熒光分析MSC 治療組心肌中檢測到Arg-1 強表達。2009年KIM 等[11]研究發現，將MSC 和巨噬細胞體外共培養可以促進巨噬細胞轉化為M2 型，其細胞高表達CD206。2013年ABUMAREE 等[12]研究進一步證實MSC 可以促進M1 型巨噬細胞轉化為M2 型，研究者將單核細胞在加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的培養基中培養7 d，成功地將單核細胞定向分化為M1 型巨噬細胞，再與MSC 共培養3 d，通過流式細胞術發現其CD14、CD36、CD163、CD204 及CD206 等M2 型細胞表型增加。以上研究均在非心肌細胞缺血缺氧狀態下進行。本實驗在以OGD 處理的心肌細胞培養基上清液模擬心肌缺氧狀態下進行，結果顯示，與M0組比較，模擬心肌缺氧狀態下成功誘導M1極化；再與MSC 共培養促進M1 極化向M2 轉化。

Toll 樣受體是細胞膜結合模式識別受體，是機體細胞免疫中的關鍵受體（包括單核細胞/巨噬細胞等炎癥細胞），在天然免疫和獲得性免疫中起核心作 用[13]。梗死心肌細胞內損傷信號分子激活炎癥細胞Toll 樣受體信號通路，誘導產生細胞因子和趨化因子表達上調（包括單核細胞/巨噬細胞等炎癥細胞），促進炎癥的發生和發展[14-15]。TLR2 和TLR4 是Toll 樣受體家族中的重要亞型，其主要參與梗死后心肌的炎癥反應[16]。髓樣分化因子88 是Toll 樣受體信號傳導通路的一個關鍵分子，是多種受體信號下游傳導的核心環節。Toll 樣受體下游信號通路中髓樣分化因子88依賴的細胞NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號通路的激活在炎癥介質的釋放及免疫調節過程中發揮重要作用[17-20]。 本研究結果表明，OGD 培養的心肌細胞上清液誘導M0 巨噬細胞極化成M1 型，且TLR2、TLR4 及髓樣分化因子表達上升，TLR2、TLR4 及髓樣分化因子88 下游的NF-κB 和MAPK 信號通路標記分子P65、IKKAα/β、JNK1/2、P38 及ERK1/2 磷酸化水平增加；加入MSC 共培養后TLR2、TLR4 及髓樣分化因子88表達下降，且其下游的NF-κB 和MAPK 信號通路標記分子P65、IKKAα/β、JNK1/2、P38 及ERK1/2 的磷酸化水平下降。

綜上所述，本研究證實MSC 調節巨噬細胞亞型之間轉化的機制之一是通過抑制TLR2、TLR4 及髓樣分化因子88 下游的NF-κB 和MAPK 信號通路，進一步認識MSC 治療急性心梗抗炎與促進心臟修復的機制，為今后研究巨噬細胞亞型轉化參與組織抗炎與組織修復提供新的理論依據與干預靶點。