結腸癌組織中WWP1、C-myc的表達及臨床意義*

孫光源，武亮，張月，薛軍，史玉潔，李文賢

（河北北方學院附屬第一醫院 1.普外科，2.手術室，3.乳腺外科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫院 4.藥劑科，5.內分泌科，河北 張家口 075100）

結腸癌發病率居惡性腫瘤第3 位[1]。近年來我國結腸癌發病率有逐年升高的趨勢[2]。劉清安等[3]報道指出,我國結腸癌患者5年生存率約為32%，因此深入探討結腸癌進展的影響因素十分重要。WWP1 蛋白主要定位于細胞漿，在乳腺癌[4]、前列腺癌[5]等惡性腫瘤中起促癌作用。而癌基因C-myc表達C-myc 蛋白主要定位于細胞核，也可見于細胞質，可調控癌基因p53家族的表達，加速乳腺癌的進展[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2017年12月河北北方學院附屬第一醫院收治的135 例結腸癌患者的石蠟標本。所選標本由結腸癌根治術術中獲取，結腸癌標本取自腫瘤組織中央非壞死區域，癌旁正常組織標本取自距離腫瘤組織＞5 cm 非腫瘤組織。其中，男性71 例，女性64 例；年齡＜55 歲42 例，≥55 歲93 例；腫瘤位于右半結腸58 例，左半結腸77 例；腫瘤直徑＜5 cm 96 例，≥5 cm 39 例；腫瘤分化程度：高分化者11 例，中分化者61 例，低分化者63 例；Dukes 分期：A 期51 例，B 期14 例，C 期70 例，未納入D 期患者；浸潤深度：T1、T2者84 例，T3、T4者51 例；無淋巴結轉移65 例，有淋巴結轉移70 例。納入標準：①經病理科確診為原發性結腸癌；②患者病歷、隨訪資料完整，組織蠟塊標本保存完好；③未合并其他惡性腫瘤；④未 合并其他影響免疫組織化學結果的嚴重疾病。排除標準：①臨床病歷資料、組織蠟塊標本缺失及污損，出院后失訪；②手術時年齡≥70 歲；③外科手術前已接受其他抗腫瘤手段治療；④其他生化指標異常。本研究通過本院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 免疫組織化學法

1.2.1 主要試劑 即用型二抗SP 試劑盒（上海優予生物科技有限公司），WWP1、C-myc 免疫組織化學法所用一抗分別為鼠抗人WWP1 單克隆抗體、鼠抗人C-myc 蛋白單克隆抗體（美國Novus 生物有限公司），二抗為生物素化兔抗鼠IgG（美國Boster 公司），辣根酶標記的鏈霉素卵蛋白素（上海優予生物科技有限公司）。

1.2.2 實驗步驟及結果判定 將石蠟標本以4μm 為間隔進行連續切片，常規脫蠟水化，滴加3%過氧化氫H2O2室溫孵育20 min，加入乙二胺四乙酸抗原修復液后，微波修復20 min。待切片自然冷卻，加入一抗，4℃孵育過夜。待切片恢復至室溫，滴加二抗工作液，37℃孵育10 min。滴加辣根酶標記的鏈霉素卵蛋白素，37℃孵育10 min。二氨基聯苯胺法顯色，蘇木精復染。常規脫水、制片及封膠。本研究陰性對照均采用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗。染色結果由2 位病理科醫師獨立判斷，取組織切片于200 倍光鏡下，取5 個不同視野，每個視野含≥100 個細胞，最終結果取各視野評分的算術平均數。將結果分為染色評分與計數評分。①染色評分：無染色計0 分，淺黃色至黃色計1 分，黃棕色計2 分，紅棕色至褐色計3 分；②計數評分：染色細胞＜6%計0 分，6%～33%計1 分，34%～66%計2 分，＞66%計3 分。將染色評分×計數評分作為總分，總分＜2 分為表達陰性，≥2 分為陽性。

1.3 隨訪

以患者出院為觀察起點，利用電話等電子通訊手段，結合患者復診病歷，對患者及家屬進行隨訪。對納入患者生存情況、治療情況及死亡原因等各種出院后的情況進行登記，所有患者登記無進展生存期（progress free survival,PFS）與總生存期（overall survival,OS）。隨訪截止于2018年7月31日，隨訪時長7～65 個月，平均（32.39±14.50）個月，中位隨訪時長30 個月。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制PFS 和OS 比率，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素分析用多因素Cox 回歸模型，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸組織中WWP1、C-myc 的表達

免疫組織化學染色結果顯示，結腸癌組織WWP1蛋白陽性表達率為74.81%，癌旁正常組織WWP1 蛋白陽性表達率為21.48%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=76.905，P=0.000）；結腸癌組織WWP1 蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織。結腸癌組織C-myc蛋白陽性表達率為67.41%，癌旁正常組織C-myc 蛋白陽性表達率為8.89%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=97.963，P=0.000）；結腸癌組織C-myc 蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織。見圖1。

圖1 結腸組織中WWP1、C-myc 蛋白的表達 （免疫組織化學×200）

2.2 不同影響因素的結腸癌組織中WWP1、C-myc 蛋白陽性表達率的比較

結腸癌組織WWP1、C-myc 蛋白表達受患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑及腫瘤分化程度的影響較小（P＞0.05），而受腫瘤Dukes 分期、浸潤深度及淋巴結轉移的影響較大（P＜0.05）。見表1。

表1 不同影響因素的結腸癌組織中WWP1、C-myc 蛋白陽性表達率的比較

續表1

2.3 結腸癌組織WWP1、C-myc 表達對患者預后的影響

2.3.1 結腸癌組織WWP1 表達對患者PFS 的影響 結腸癌組織中，WWP1 陰性表達組隨訪期間PFS 比率為61.76%，平均PFS（46.07±3.99）個月；而WWP1陽性表達組隨訪期間PFS 比率為27.72%，平均PFS（28.53±1.98）個月。兩組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=12.749，P=0.000），WWP1陰性表達組PFS 比率較高。見圖2。

2.3.2 結腸癌組織C-myc 表達對患者PFS 的影響 結腸癌組織中，C-myc 陰性表達組隨訪期間PFS 比率為56.82%，平均PFS（42.86±3.57）個月；而C-myc陽性表達組隨訪期間PFS 比率為26.37%，平均PFS（28.43±2.10）個月。兩組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=11.889，P=0.001），C-myc 陰性表達組PFS 比率較高。見圖2。

2.3.3 結腸癌組織WWP1 表達對患者OS 的影響 結腸癌組織中，WWP1 陰性表達組隨訪期間OS 比率為76.47%，平均OS（54.72±3.02）個月；而WWP1陽性表達組隨訪期間OS 比率為47.52%，平均OS（39.55±2.22）個月。兩組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.605，P=0.003）；WWP1 陰性表達組OS 比率較高。見圖3。

2.3.4 結腸癌組織C-myc 表達對患者OS 的影響 結腸癌組織中，C-myc 陰性表達組隨訪期間OS 比率為72.73%，平均OS（51.78±3.10）個月；而C-myc陽性表達組隨訪期間OS 比率為46.15%，平均OS（39.68±2.30）個月。兩組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.456，P=0.004）；C-myc 陰性表達組OS 比率較高。見圖3。

圖2 結腸癌組織中WWP1、C-myc 表達對患者PFS 的影響

圖3 結腸癌組織中WWP1、C-myc 表達對患者OS 的影響

2.4 Cox 回歸分析結腸癌患者預后的危險因素

建立Cox 回歸分析模型，以結腸癌患者預后作為應變量，列示的各指標變量作為自變量（見表1），以全子集回歸方式將其納入回歸。結果顯示，影響結腸癌患者預后的獨立危險因素有分化程度、腫瘤Dukes 分期、浸潤深度、淋巴結轉移、WWP1 表達及C-myc 表達（P＜0.05）。見表2。

表2 Cox 回歸分析結腸癌患者預后危險因素的相關參數

3 討論

結腸癌早期臨床癥狀隱匿，≥50%結腸癌患者初次就診時已出現淋巴結轉移，造成預后差[7]。早期診斷、合理治療是提高結腸癌患者預后的研究方向。

許多研究將泛素連接酶作為尋找惡性腫瘤治療靶點的研究重點[8-10]。WWP1 屬于E3 泛素連接酶，可調控轉化生長因子-β（TGF-β）[11]、10 號染色體同源丟失性磷酸張力蛋白基因[12]相關的信號通路，下調蠕蟲果蠅母抗同源蛋白（Smad）[13]，調節鋅指蛋白轉錄因子5[14]，發揮促癌基因樣作用。體外研究結果表明，WWP1 能泛素化Smad4 蛋白和TGF-β 受體[15]。本研究結果可推斷，WWP1 對于結腸癌細胞的侵襲過程有促進作用。

C-myc基因編碼蛋白質是一種短半衰蛋白，對機體的細胞周期、細胞凋亡等具有調控作用。病理狀態下，C-myc 可調控癌基因p53家族的表達，促進乳腺癌的進展[16]；同時在肺癌[17]及骨肉瘤[18]等惡性腫瘤中也呈高表達，具有一定的診斷價值。本研究結果表明，C-myc 在結腸癌組織中同樣出現促癌基因樣作用，可作為結腸癌診斷相關的腫瘤標志物。但關于乳腺癌的研究顯示，C-myc基因與乳腺癌的分化程度、病理分型相關[16]。而本研究結果中C-myc 的表達卻與結腸癌的分化程度無關，這可能由于乳腺癌同時受性激素受體調節，C-myc 與雌激素受體存在相互作用，而結腸癌受性激素影響較小。由本研究結果可推測，C-myc 在結腸癌中的作用位點近似于骨肉瘤中，即與TGF-β 受體相關[18]，但需要進一步的實驗驗證。

C-myc基因表達產物的主要降解途徑是泛素連接酶系統[19-21]。而WWP1 屬于E3 泛素連接酶。本研究結果可推測，WWP1 在結腸癌中的作用機制可能是泛素化降解C-myc 蛋白。然而WWP1 作用位點眾多，C-myc 可能僅是其中一個通路，其他的路徑仍然有待后續研究探明。

隨訪結果顯示，由于WWP1、C-myc 能促進癌細胞侵襲、轉移，因此其陽性表達的結腸癌組織惡性程度較高，易出現轉移、復發。所以監測結腸癌組織中WWP1、C-myc 表達不僅對結腸癌的診斷具有參考價值，而且可作為對患者預后評估的參考。

綜上所述，結腸癌組織中WWP1、C-myc 表達均異常高表達，且與結腸癌的侵襲、遷移密切相關。結腸癌組織中WWP1、C-myc 陽性表達患者的預后較差，且WWP1、C-myc 高表達是影響結腸癌患者術后生存期的危險因素。因此推斷WWP1、C-myc 可能共同參與結腸癌的發生、進展，可作為結腸癌患者預后的參考指標。