急性冠狀動脈綜合征患者外周血β2整合素和Fractalkine的表達水平及機制研究

朱銳，吳校林，周青，李彬，李宸宇

（襄陽市中心醫院 心血管內科，湖北 襄陽 441021）

急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS）主要是不穩定的冠狀動脈粥樣硬化斑塊發生破裂，并伴發炎癥激活、血小板聚集及血栓形成導致血管完全或不完全閉塞而引起心肌缺血壞死的臨床綜合征[1]。斑塊和血液中的淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞等炎癥細胞及其分泌的炎癥因子密切影響著動脈粥樣硬化和ACS 的發生、發展[2]。Fractalkine 作為一種常見的炎癥趨化因子，可與白細胞表面的受體結合，觸發β2 整合素和黏附分子的表達和活化，參與動脈粥樣硬化的炎癥反應過程[3]。因此，筆者對ACS 患者血液中的Fractalkine、β2 整合素[（淋巴細胞功能相關抗原1（LFA-1）、CD11a/CD18 巨噬細胞分子1（CD11b/CD18,Mac-1）]、細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）等指標進行檢測并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2017年10月襄陽市中心醫院收治的86 例ACS 患者。其中，不穩定型心絞痛（unstable angina pectoris,UA）32 例（UA 組），急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）54 例（AMI組），同時選取20 例冠狀動脈造影正常患者（正常組）和28例穩定型心絞痛（stable angina pectoris,SAP）患者（SAP 組）作為對照。納入標準：所有患者均行冠狀動脈造影檢查且診斷均符合臨床診斷標準。排除標準：感染性疾病、先天性心臟病、瓣膜性心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤及嚴重心腎功能不全。4 組患者年齡、性別、危險因素及服藥情況等具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術 采用流式細胞術檢測β2 整合素LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18）的表達。所有患者于入院后第2 天清晨空腹采肘靜脈血2 ml 置于含乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，混勻后取100μl 全血加入10μl 異硫氫酸熒光素標記的鼠抗人CD11a 抗體（美國BD 公司）和10μl 藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）標記的鼠抗人CD18 抗體（美國BD 公司）置于A 管中；100μl 全血加入10μl FITC標記的鼠抗人CD11b 抗體（美國BD 公司）和10μl PE 標記的鼠抗人CD18 抗體置于B 管中；C 管中加入100μl 全血和陰性對照抗體（美國BD 公司）。室溫孵育30 min，每管中加入1 ml 紅細胞裂解液混勻后避光反應10 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 ml 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）洗滌2 次，沉淀的白細胞加入0.5 ml PBS 緩沖液后上機檢測。采用FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）檢測10 000 個細胞，Cell Quest 軟件分析，結果以陽性細胞百分率表示。

1.2.2 血清Fractalkine 和ICAM-1 的檢測 抽取空腹靜脈血2 ml 置于無任何添加劑的采血管中，2 h 內以2 000 r/min 離心10 min，取上層血清于環氧樹脂管中并保存在-70℃冰箱中備用。血清中Fractalkine 和ICAM-1 的水平采用酶聯免疫吸附法測定，酶標儀為瑞士Tecan 公司產品，操作步驟嚴格按照試劑盒（美國Elabscience 公司）說明書進行并繪制標準曲線。

1.2.3 Western blotting 檢測 1 ml 靜脈血加入5 ml紅細胞裂解液混勻后避光反應10 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入5 ml PBS 緩沖液洗滌2 次；再向沉淀的白細胞中加入1.5 ml 總蛋白提取液4℃下14 000 r/min 離心30 min，取上清保存備用。取20μg蛋白樣品，SDS-PAGE 電泳，100 V 轉移約1 h，溴酚藍到達分離膠的底端處附近即可停止電泳。再將蛋白電泳轉移至聚偏氟乙烯膜上，放入封閉液中37℃封閉1 h；加入武漢博士德公司的抗黏著斑激酶 （focal adhesion kinase,FAK）抗體（1：500）和抗蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）抗體（1：500），4℃過夜，反復洗膜后，將膜與相應的二抗孵育，室溫下輕搖1 h，洗膜后放入顯影液顯影，定影液定影，將膠片掃描得到照片。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較

4 組患者臨床資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。4 組患者住院期間均服用他汀類藥物和雙抗血小板藥物（阿司匹林加氯吡格雷或替格瑞洛）。見表1。

表1 4 組患者臨床資料比較

2.2 LFA-1、Mac-1 水平比較

4 組患者外周血白細胞中LFA-1（CD11a/CD18）、Mac-1（CD11b/CD18）陽性細胞百分率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；AMI 組和UA組患者LFA-1、Mac-1 陽性細胞百分率高于SAP 組和正常組患者（P＜0.05），且AMI 組患者LFA-1 和Mac-1 陽性細胞百分率較UA 組患者更高（P＜0.05）。見表2。

表2 4 組患者LFA-1、Mac-1 水平比較 %

2.3 血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較

4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；與SAP組患者相比，AMI 組和UA 組患者較SAP 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平升高（P＜0.05），且AMI組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平較其他3 組高（P＜0.05）。見表3。

2.4 外周血白細胞FAK、PKB 蛋白水平比較

正常組、SAP 組、UA 組及AMI 組患者外周血白細胞FAK 蛋白相對表達水平分別為（0.545±0.027）、（0.659±0.039）、（0.783±0.039）及（0.942±0.079），4 組患者外周血白細胞FAK 蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=12.497，P=0.002）；UA 組和AMI 組患者FAK 蛋白水平高于SAP 組患者（P＜0.05）。正常組、SAP 組、UA 組、AMI 組患者外周血白細胞PKB 蛋白相對表達水平分別為（0.584±0.011）、（0.620±0.016）、（0.758±0.030）及（0.853±0.044）。4 組患者外周血白細胞PKB 蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=19.431，P=0.000）；UA 組和AMI 組患者PKB 蛋白水平高于SAP 患者（P＜0.05）。正常組和SAP 組患者FAK 和PKB 蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、2。

表3 4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較 （±s）

表3 4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較 （±s）

組別 n Fractalkine/（ng/L） ICAM-1/（ng/ml）正常組 20 442.7±32.1 157.9±37.8 SAP 組 28 571.6±37.7 359.9±45.2 UA 組 32 683.4±49.6 438.34±48.6 AMI 組 54 873.1±55.4 530.3±60.1 F 值 83.334 53.072 P 值 0.000 0.000

圖1 4 組患者外周血白細胞FAK、PKB 蛋白的表達

圖2 4 組患者外周血白細胞FAK、PKB 蛋白水平比較 （±s）

3 討論

動脈粥樣硬化是一種血管慢性炎癥反應性疾病。ACS 是動脈粥樣硬化的主要臨床表現，包括ST 段抬高型心肌梗死、非ST 段抬高型心肌梗死及UA[4]。ACS 通常是易損的粥樣硬化斑塊破裂或不穩定引起相關的冠狀動脈部分或完全閉塞。易損斑塊中含有大量的炎癥細胞，斑塊破裂后將引起血管中的白細胞聚集、黏附、游走、侵蝕。炎癥細胞激活，合成和釋放趨化因子、生長因子等炎癥細胞因子，放大炎癥反應，并促進白細胞β2 整合素與黏附分子結合、血小板聚集、血栓形成及血管平滑肌細胞增殖，導致血管狹窄或閉塞[2，4-5]。因此，冠狀動脈局部或全身的炎癥反應在急性心肌缺血事件中起著重要的作用。

整合素是一類廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，是細胞外基質環境和細胞內信號傳導的紐帶。其主要介導細胞與細胞外基質、細胞和細胞之間的黏附，細胞遷移，參與止血、血管生成及胚胎形成等生理過程[6-7]。其中β2 整合素只表達于白細胞，也稱之白細胞整合素，在炎癥反應中具有重要作用。LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18） 是β2 整合素的兩個重要成員，其可與配體ICAM-1 結合，調節白細胞穩定黏附到血管內皮細胞上，為白細胞穿越血管內皮提供條件，便于白細胞游走到炎癥部位并發揮致炎作用[8]。Fractalkine 也稱為CX3CL1，是趨化因子CX3C 亞家族的唯一成員，其受體CX3CR1 主要表達在T 淋巴細胞、單核細胞和自然殺傷細胞上，介導Fractalkine 的趨化作用[3]。研究發現，Fractalkine/CX3CR1 信號通路參與動脈粥樣硬化的炎癥反應過程，主要起促炎癥反應的作用[9]。Fractalkine 不僅可介導白細胞黏附和跨膜轉移過程促進循環中白細胞游出；還誘導IFN-γ、TNF-α 表達，損傷內皮細胞，促使巨噬細胞釋放基質金屬蛋白酶降解粥樣硬化斑塊纖維組織中膠原蛋白，導致纖維帽變薄，斑塊出現潰瘍或破裂，誘發ACS[3，9]。筆者研究發現，ACS 患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平和外周血白細胞中LFA-1、Mac-1 陽性細胞百分率高于冠狀動脈造影正常和穩定型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）患者，提示Fractalkine、ICAM-1、LFA-1 及Mac-1 參與ACS 局部和全身的炎癥反應并且相互作用，且AMI 時這些炎癥指標最高，炎癥反應最強，這與國外的研究結果一致。

既往研究發現，當整合素與ICAM-1 等配體結合后，FAK 構象改變，使Tyr397 自身磷酸化，Tyr397通過結合磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）的p85 亞基SH2 結構域激活PI3K途徑。PKB為PI3K的下游信號，參與白細胞活化、心肌缺血再灌注、細胞增殖及凋亡等很多重要的生理過程[10-11]。筆者通過Western blotting 技術檢測外周血白細胞FAK、PKB 蛋白表達水平，結果發現ACS 患者FAK、PKB 蛋白水平較冠狀動脈造影正常和穩定型冠心病患者升高。這一系列研究結果表明，ACS 時外周循環中β2 整合素、FRACTALKINE 等趨化因子及黏附分子表達增加、水平增高，增加的Fractalkine與白細胞表面的受體結合后促進β2 整合素LFA-1、Mac-1 及黏附分子ICAM-1 活化，激活FAK-PI3K/PKB 信號通路參與ACS 的炎癥反應。

綜上所述，隨著筆者對不穩定粥樣硬化斑塊和ACS 炎癥反應機制的進一步認識，有助于尋找ACS 新的治療靶點，為ACS 的防治提供新的方向。