黃曲霉毒素B1的分子致毒機理及其微生物脫毒研究進展

趙 萌，高 婧，褚華碩,2，梁志宏,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083；2.北京大偉嘉生物技術股份有限公司，微生態制劑關鍵技術開發北京工程實驗室，北京市飼用微生態制劑工程技術研究中心，北京 100085）

真菌毒素作為一類具有毒性的次級代謝產物，主要由曲霉菌屬（Aspergillus spp.）、青霉菌屬（Penicillium spp.）、鐮孢菌屬（Fusarium spp.）和鏈格孢屬（Alternaria spp.）等真菌產生[1]。2012年歐盟食品和飼料類快速預警系統通報中指出，真菌毒素是歐盟邊界通報的主要風險因子。而黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是通報中的最主要的真菌毒素，占所有通報真菌毒素的92%左右[2]。AFT是一類化學結構類似的二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）產生[3]。在4 種主要的AFT（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）中，AFB1具有最強的毒性和致癌性，可在農作物生長、農產品收獲、運輸、貯藏等多個環節發生污染[4]，主要分布在堅果、花生、玉米、小麥和大豆等食品和糧食中，2002年被國際癌癥研究機構列為I級強致癌物[5]。

由于AFB1對人和動物具有危害，有必要采取有效的脫毒方式控制它們在食物中的污染。已經報道在食物和飼料中脫除AFB1的幾種策略包括加熱、輻射和等離子降解等物理方法[6-8]以及臭氧、過氧化氫和檸檬酸處理等化學方法[9-11]。物理法因其方便、快速、高效的優點廣泛應用于食品行業，但存在儀器成本高、可能改變物質性質和產生輻射污染等缺點[12]。化學法主要是運用化學試劑與AFB1分子發生反應，破壞其毒性結構，進而達到脫毒效果。該方法處理簡單、成本低，但可能出現二次污染、破壞產品營養成分等危害[13]。微生物脫毒因其特異性強、污染小、能夠保證食品營養安全等優點成為最具發展前景的方法[14]。目前，微生物法主要利用微生物菌體本身、代謝產物以及脫毒酶進行脫毒，但仍然存在菌體功能不穩定、脫毒物質分離純化難度大等一系列問題。因此，了解AFB1的毒性機理并探索有效的脫除方法有重要意義。本文綜述AFB1毒性機理及近年來微生物脫毒的研究進展，總結細菌、真菌和脫毒酶的發現和作用機理，并對探索高效、無污染的AFB1脫毒技術的前景進行展望。

1 AFB1的結構和理化特性

表1 AFT分類及結構[15]Table 1 Classification and structures of AFTs[15]

圖1 AFT結構通式Fig. 1 Structures of AFTs

AFT均為多環芳烴化合物，有20多種結構，根據其化學結構將其分為兩大類（表1）[15]：二氫呋喃香豆素環戊烯酮組包括B組AFT（AFB1、AFB2、AFB2a）、M組AFT（AFM1、AFM2）、黃曲霉毒醇（aflatoxicol，AFL）和AFQ1；二氫呋喃香豆素內酯組包含G組AFT（AFG1、AFG2、AFG2a）（圖1）。其中，AFM1和AFM2分別是AFB1和AFB2的代謝產物。AFT為熒光化合物，在紫外光下，B組AFT發出藍色熒光，而G組AFT顯示綠色熒光。各種AFT毒性順序是AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFM2＞AFG2，其中AFB1毒性最強。根據大鼠口服實驗結果，AFB1的動物半數致死量為4.8 mg/kg，其毒性是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍，能引起人和動物急性中毒死亡[16]。

AFB1分子式為C17H12O6，相對分子質量為312.06，在紫外光照射下非常穩定，在269 ℃左右高溫下才會分解。其在中性條件下穩定，在pH 1.0～3.0的強酸性溶液中才有極少量的分解，但在pH 9.0～10.0的堿性溶液中易分解。AFB1易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等多種有機溶劑，但不溶于乙醚、石油醚、己烷和水，因此普通的物理和化學方法難以將其徹底脫除[17]。

目前，我國的飼料、堅果、牛奶等食品中仍可檢測出AFB1，甚至存在含量超標的情況。徐進棟等[18]采集了山東省各地規模化動物養殖場、各大飼料廠及養殖戶的1 037 份樣品測定AFB1含量。結果表明，山東省飼料原料AFB1超標率分別為：玉米27.71%、花生餅粕23.27%、玉米胚芽粕4.92%。AFB1污染仍是食品、飼料等行業中亟待解決的問題。因此，了解AFB1毒性機理以及脫毒研究概況對探索有效的脫毒方式具有一定的意義。

2 AFB1的毒性機理

AFT具有高毒性和致癌性，它對人類和動物健康的危害已引起各國科研工作者的廣泛關注。目前，研究者對AFB1毒性的研究包括其對實驗動物的致癌毒性、基因毒性、生殖毒性、免疫毒性以及神經毒性等[19]。AFT一方面直接影響動物機體健康；另一方面會轉移到畜禽產品（肉、奶、蛋）中，通過食物鏈威脅人類健康。人類的AFT急性中毒通常與誤食了被AFT污染的食品有關，往往發展為急性肝炎、膽管增生、肝細胞壞死、肝充血出血，還會出現典型變化如黃疸、發熱、食欲減退、厭食和腹瀉，嚴重者會發生肝脾腫大、肝區疼痛、黏膜黃染、肝功能異常等中毒性癥狀，也可能出現痙攣、昏迷等危險狀況[20]。AFB1具有嚴重的慢性毒性作用,具有明確的致癌性,能夠造成嚴重肝損傷甚至引發肝癌，且會對人體造成一系列其他生理方面的損害，如在大劑量下引發急性毒作用甚至死亡，或慢性亞致死劑量造成人體營養缺乏癥以及免疫系統損害[21]。了解AFB1致毒機理和毒性位點可以為探索有效的脫毒劑研究提供一定的理論依據。

2.1 致毒機理

AFB1經細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）氧化酶形成的活性代謝物AFB1-8,9-環氧化合物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）及隨后與DNA、RNA和蛋白質的共價結合是其發揮毒性作用的主要機制[4]。AFB1的致癌和致突變效應與其代謝過程有關，其中環氧化過程是致毒代謝過程，而羥基化、水合和去甲基化被認為是解毒代謝過程。AFB1的主要靶器官是肝臟，動物攝入AFB1后，經肝微粒體CYP450將其代謝為親電子的AFBO，然后結合DNA和蛋白質等大分子形成加合物，可引起較強的肝損傷和肝致癌性。AFBO與DNA鏈鳥苷酸殘基上的N7結合，形成AFB1-N7-鳥嘌呤加合物，導致DNA損傷和基因突變，表現為基因毒性；AFBO與蛋白質結合形成AFB1-賴氨酸加合物，抑制細胞中蛋白質的合成，導致細胞死亡。然而，AFBO可通過環氧化物水解酶和谷胱甘肽硫基轉移酶轉化為毒性較低的AFB1-二氫二醇和尿酸的方式解毒。AFB1也可經過羥基化作用轉化為AFM1、AFP1、AFQ1和AFL，前三者經尿液直接排出或與葡萄糖醛酸基轉移酶結合經糞便排出，是重要的解毒環節；而AFL又會被氧化成AFB1，繼續發揮毒性作用（圖2）。另外，AFB1的致癌毒性還與某些基因有關，其致癌的分子機制主要是致癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究表明，AFB1可引起致癌基因（如ras、c-fos）及抑癌基因（如p53、survivin）表達水平的改變[22-23]。

圖2 AFB1的毒性機理示意圖[4]Fig. 2 Schematic diagram of the toxic mechanism of AFB[4]1

2.2 AFB1毒性位點

如圖3所示，AFB1結構中主要有3 個毒性位點[24]，其中：第1個毒性位點是位于呋喃環上的8、9位雙鍵，其是AFB1與蛋白和核酸形成加合物的作用位點，是基因突變和致癌、致畸的主要功能基團；第2個毒性位點是位于AFB1中香豆素的內酯環部分的10、11、15號位點，這個位點在氨化時被水解，形成仍然保留8,9-雙呋喃環雙鍵的AFD1；第3個毒性位點是AFB1環戊烯酮環，通過加成、酮羰基還原的一些取代基團對AFB1的毒性有一定的影響。因此，破壞AFB1的毒性位點是可能的脫毒機理。

目前對于AFB1毒性位點的研究主要是通過破壞毒素分子的毒性位點結構、生成毒性較低產物的過程。已經有大量關于微生物或酶對AFB1結構的破壞作用及產物的研究。Wang Jianqiao等[25]從白腐真菌的Phanerochaete sordida YK-624中純化出的錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）主要是通過作用于AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵生成AFB1-二氫二醇，從而達到脫毒的目的。有研究發現AFT降解酶（aflatoxin-detoxizyme，ADTZ）同樣作用于AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵，在生成AFB1-二氫二醇的基礎上進一步打開呋喃環[26]。Jin等[27]發現AFB1被微生物降解后發生羥化，生成毒性較低的熒光化合物AFB2a。綠色木霉（Trichoderma viride）、不明毛霉（Mucor ambiguous）和黑曲霉（Aspergillus niger）將AFB1的2-環戊烯酮環上的酮羰基還原形成AFL，其毒性比AFB1低[28]。Taylor等[29]從恥垢分歧桿菌（Mycobacterium smegmatis）中分離純化得到的過氧化氫酶可以使AFB1的α,β-不飽合酯還原，從而使AFB1水解形成一種新的無毒的降解產物。

圖3 AFB1的毒性位點及產物Fig. 3 Toxicity sites and products of AFB1

3 微生物脫毒方法及其機制

目前，AFB1的脫毒方法分為物理法、化學法以及微生物法。微生物法因其具有高效、特異性強、對環境友好、污染小等優點成為目前的研究熱點。微生物脫毒指利用微生物本身特性及代謝產物來修飾毒素分子或破壞其毒性結構，進而達到脫毒的目的。根據聯合國糧食及農業組織的規定，AFT的脫毒工藝必須滿足以下條件：1）去除AFT或者使之失去活性；2）不產生任何有毒的副產物；3）破壞產毒的真菌孢子或菌絲體；4）脫毒后食品或飼料應保持其原有的營養價值和適口性[17]。

目前，微生物脫毒方法主要表現為兩個方面：一是利用微生物菌體本身吸附AFB1，這主要與細胞壁的成分有關，研究最多的是乳酸菌和酵母菌；二是一些微生物在發酵過程中可以產生代謝產物（主要為胞外酶）降解AFB1，目前已經發現了幾種脫毒酶，但大多數研究停留在脫毒活性物質的粗提物上，脫毒活性物質的純化以及菌體脫毒功能的不穩定性仍是目前研究的瓶頸。以下主要介紹對AFB1具有吸附和降解作用的微生物及其脫毒酶的研究進展。

3.1 微生物的吸附作用對AFB1的脫除

自然界中有些微生物的脫毒方式與菌體本身的性質如細胞壁成分有關，微生物的吸附作用是指微生物利用細胞壁的某種成分或結構可以吸附AFB1，如細菌中研究最多的乳酸菌、真菌中的酵母菌等益生菌，都是通過形成菌體-毒素復合體發揮作用的[30]。

3.1.1 乳酸菌對AFB1的吸附

用于吸附AFB1的所有細菌中，被研究最多的是乳酸菌（Lactobacillus）[31]。其脫毒機理主要是通過細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺為主要成分的肽聚糖對AFB1進行物理吸附，這類微生物可用作食品發酵添加劑。Hernandez等[32]篩選出的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei L30）對AFB1的吸附率為49.2%，其主要是通過細胞壁產生胞壁酸與AFB1形成穩定的毒素-菌體復合物發揮作用；隨后的反復水洗實驗證明了其吸附作用有限且可逆。Bovo等[33]研究滅活的鼠李糖乳桿菌通過噴霧干燥或冷凍干燥后對AFB1和菌體細胞的結合效果，發現細胞在噴霧干燥過程中因破壞了細菌細胞壁的結構和功能而完全喪失AFB1結合能力，因而在冷凍干燥過程中保持完整。因此，冷凍干燥的鼠李糖乳桿菌細胞可以成為AFB1污染食品的有效脫毒產品。Taheur等[34]從開菲爾培養物中分離出對AFB1吸附和生物轉化能力強的乳酸桿菌（Lactobacillus kefiri），當pH值為4.8時，其在牛奶中能吸附82% AFB1，在解吸實驗后仍保留65% AFB1。

3.1.2 酵母菌對AFB1的吸附

酵母細胞因其細胞壁中含有葡聚糖、甘露聚糖、幾丁質等特殊成分，能夠對毒素產生吸附作用。劉暢等[35]首次篩選出了吸附效果較佳的釀酒酵母Y1（Saccharomyces cerevisiae Y1），其對AFB1的吸附率達81.16%，實驗表明Y1與AFB1通過物理方式結合，結合物可通過離心和過濾方式除去以保證吸附后食品的安全性，因此可廣泛應用作飼料添加劑。錢潘攀等[36]利用麝香草酚裂解酵母細胞，同時以酵母膜脂為載體，與細胞壁共同組成具備抑制黃曲霉孢子萌發和吸附毒素能力的雙效型細胞壁提取物。結果表明，麝香草酚可以誘導酵母細胞發生裂解，導致細胞壁上肽聚糖的結構發生變化、細胞內容物釋放，增強了對AFB1的吸附能力。該產品對AFB1的吸附量達到2.5 μg/mg，為糧食、飼料中控制AFT污染提供了新的研究思路及理論依據。Martínez等[37]研究了從虹鱒魚腸和魚飼料中分離的酵母對AFB1的吸附能力，以評估其在飼料添加劑中的應用。結果表明，漢遜德巴利酵母RC031（Debaryomyces hansenii RC031）與AFB1在25 ℃孵育1 h的吸附率達21%，可以作為益生菌使用來改善虹鱒魚的產量。

另外，某些芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）[38]、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp.）、鐮刀菌屬（Fusarium spp.）等益生菌細胞對毒素有一定的吸附作用[25]。與物理吸附不同，微生物對AFB1的吸附效率不受吸附劑孔徑大小、接觸面積等影響，其通過形成菌體-毒素復合物如胞壁糖、胞壁酸，使毒素難以被機體吸收。但許多微生物對毒素的吸附沒有特異性，只是以非共價方式結合，受環境影響較大，不能從根本上脫除毒性。

3.2 微生物的降解作用對AFB1的脫除

微生物降解AFB1是利用微生物產生的代謝產物或分泌的蛋白酶破壞毒素分子的毒性結構，產生無毒無害降解產物的過程。其降解機制主要是破壞AFB1的毒性結構位點，即雙呋喃環末端雙鍵、內酯環和環戊烯酮環。微生物的降解作用主要通過微生物酶促反應進行，包括經純化獲得的脫毒酶以及微生物發酵粗提液的作用。

3.2.1 脫毒酶對AFB1的降解

降解AFB1的脫毒酶已被從不同的微生物系統中提取和純化。脫毒酶解毒避免了微生物吸附脫毒的缺點，且安全高效、環境友好、特異性強，已經應用于食品和飼料工業中[39]。負責降解AFB1的酶已經被分離、純化和鑒定，包括漆酶、AF氧化酶（aflatoxin-oxidase，AFO）、辣根過氧化物酶、MnP、F420H2依賴性還原酶（F420H2dependent reductases，FDR）等。

3.2.1.1 氧化酶對AFB1的降解

對于氧化酶的研究，暨南大學微生物技術研究所Liu Daling等[40]的研究較深入，該團隊首先從假蜜環菌（Armillariella tabescens）細胞內發現了具有降解AFB1活性的酶，能夠完全降解AFB1，其經分離、純化并被命名為ADTZ[41]，毒理學研究發現其降解產物致突變作用降低。Cao Hong等[42]對先前純化的ADTZ進行電噴霧電離串聯質譜（electrospray ionization-mass/mass spectrometry，ESI-MS/MS）分析和堿基局部對準檢索工具檢索，推斷該酶是AFO；經高性能薄層色譜（high performance thin layer chromatography，HPTLC）分析表明其能夠水解AFB1的雙呋喃環體系。Wu Yuanzhen等[26]研究了AFO的作用位點，結果表明AFB1的8,9-不飽和碳-碳鍵是AFO的潛在反應位點。目前已經得出ADTZ的基因序列，溫思霞[43]、胡熔[44]等已經分別將其成功導入到畢赤酵母和大腸桿菌中，使其成功表達并得到高純度、有活性的rADTZ蛋白，為rADTZ蛋白結構與功能的進一步研究提供了依據。為提高ADTZ在飼料中應用的穩定性，Qiu Yuxin等[45]對AFO的蛋白質結構進行合理的設計，提高了其對胰蛋白酶的抗性。為更清楚地了解AFO結構特性，Xu Tingting等[46]發現AFO與二肽基肽酶III（dipeptidyl peptidase III，DPPIII）家族成員具有高度的序列同一性，與經典DPPIII結構不同，AFO結構全都為閉合構象，而與底物結合無關（圖4）。因此，AFO是一種具有AFO和DPPIII活性的雙活性酶，其獨特的構象特征擴展了對該酶家族反應模式的理解。

圖4 AFO的三維結構[46]Fig. 4 Three-dimensional structure of AFO[46]

另一種研究較多的氧化酶是漆酶，它是多銅氧化酶，可用作多功能生物催化劑，用于環境污染綠色生物修復。Scarpari等[47]研究了變色栓菌（Trametes versicolor）產生的漆酶在體外和玉米中對AFB1產生的影響，結果顯示1.8 U/mL漆酶48 h后在體外條件下能降解70% AFB1；體內條件下對處理7 d的玉米種子顯示出AFB1降解活性（種子中降解率為30%、磨碎的種子中為43%），且毒理學實驗降解產物不影響細胞活力，目前該菌產生的漆酶已經作為商業酶投入使用。Loi等[48]從側耳（Pleurotus pulmonarius）中分離出漆酶，進一步分離純化出Lac2，并研究其對AFB1和AFM1的降解活性。將酶活力為5 U/mL的Lac2用乙酸鈉緩沖液處理后再加入氧化還原介體乙酰丁香酮，能夠降解90% 1 mg/L AFB1，而AFM1完全被降解，因此Lac2是良好的脫毒酶制劑。目前研究人員已經獲得了該酶的基因序列，可以通過基因工程的手段大量生產AFB1脫毒酶。

3.2.1.2 過氧化物酶對AFB1的降解

目前報道的3 種不同的過氧化物酶均具有降解AFB1能力，分別從辣根、Phanerochaete sordida YK-624和Pleurotus ostreatus中提取和純化。Das等[49]將0.2 U/mL辣根過氧化物酶作用于AFB11 h后，毒素在體外降解率達到42%，在花生中降解率達到41%，毒理學實驗表明降解產物的毒性降低。Wang Jianqiao等[25]用來自白腐真菌Phanerochaete sordida YK-624的5 nkat MnP處理AFB148 h后，AFB1的降解率達86%；加入吐溫-80增強了其脫除AFB1的能力，誘變實驗表明20 nkat MnP處理AFB1使其誘變活力降低69.2%。氫核磁共振和高分辨-ESI-MS分析表明，AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-環氧化物，然后水解成AFB1-8,9-二氫二醇（圖5），這是首次關于MnP將AFB1轉化為AFB1-8,9-二氫二醇的報道。Yehia等[50]從白腐菌平菇（Pleurotus ostreatus）培養濾液中獲得MnP，發現1.5 U/mL MnP和AFB1孵育48 h其降解率達到90%，隨后分離純化得到純MnP，并對MnP-cDNA編碼基因進行測序，發現MnP-cDNA由497 bp的開放閱讀框組成，編碼165 個氨基酸，未來可以通過基因工程的手段大量生產此脫毒酶產品。

圖5 MnP和AFO對AFB1的降解機理[25]Fig. 5 Degradation mechanism of AFB1 by MnP and AFO[25]

3.2.1.3 還原酶對AFB1的降解

Taylor等[29]表征了來自恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的催化AFB1降解的FDR-A和FDR-B，其是利用去氮烷黃素輔因子F420H2催化AFT α,β-不飽和酯部分還原的活性分子（圖6）。與先前報道降解AFT的酶不同，FDR-A和FDR-B與毒素作用后使內酯環不穩定，激活分子發生加成反應進行脫毒。其屬于兩個先前未表征的FDR家族。該團隊還研究了FDR-A和FDR-B的結構，發現來自每個FDR家族的酶的晶體結構都是采用分裂的桶蛋白質折疊，具有延伸的和高度帶電的F420H2結合溝。

圖6 FDR對AFB1的降解機理[29]Fig. 6 Degradation mechanism of AFB1 by F420H2-dependent reductase[29]

3.2.1.4 其他酶對AFB1的降解

對于脫毒酶的研究中還存在一些未知特性的酶。黃色粘球菌ANSM068（Myxococcus fulvus ANSM068）的菌體上清液與毒素作用48 h后，對AFB1（71.89%）、AFG1（68.13%）和AFM1（63.82%）有較高的降解率；制備、純化和鑒定該菌中的功能酶黏細菌AFT降解酶（myxobacteria aflatoxin degradation enzyme，MADE），發現Mg2＋促進、Zn2＋強烈抑制其活性；純MADE處理毒素時，AFG1和AFM1分別降解96.96%和95.80%，然而其降解機制尚未明確[51]。Xu Liang等[52]發現從玉米、水稻和土壤樣品中獲得的對AFB1有較高還原活性的細菌分離物Bacillus shackletonii L7與毒素37 ℃作用72 h后，AFB1、AFB2和AFM1分別降解92.1%、84.1%和90.4%。他們將從煮沸的上清液中純化的熱穩定性酶命名為芽孢桿菌AFT降解酶（Bacillus aflatoxin-degrading enzyme，BADE），目前對該酶的氨基酸序列及蛋白結構在進一步研究中。

3.2.2 微生物發酵上清液粗提液對AFB1的降解

微生物發酵粗提液因其具有AFB1降解潛力而被廣泛研究，這主要是因為微生物的發酵作用產生的某種物質破壞了AFB1分子的毒性結構[53]。目前已經發現了很多細菌和真菌的發酵粗提液對AFB1的降解作用，包括嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）等細菌和假蜜環菌（Armillariella tabescens）、黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌，其主要是通過發酵粗提液的酶促反應機制達到脫毒效果。

3.2.2.1 細菌發酵粗提液對AFB1的降解

細菌能夠降解AFB1，這主要是通過發酵液的酶促反應機制，但相關研究僅停留在脫毒現象上，對其發揮作用的物質尚未確定。李俊霞等[54]以香豆素為唯一碳源和能源，得到一株對AFB1降解率達85.7%的NMO-3菌株，并鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.），這是首次分離得到降解AFB1的單胞菌屬菌株。Xia Xiaoshuang等[55]從土壤樣品中分離出降解AFB1的枯草芽孢桿菌JSW-1（Bacillus subtilis JSW-1），30 ℃孵育72 h后能夠降解67.2% AFB1，降解活性主要歸因于無細胞上清液的粗提物，并發現其具有熱穩定性，但對蛋白酶K處理敏感，表明胞外蛋白質或酶是導致AFB1降解的原因。Rao等[56]篩選出地衣芽孢桿菌CFR1（Bacillus licheniformis CFR1），其胞外成分與AFB1作用72 h后降解率達93.57%。通過HPTLC、高效液相色譜法和ESI-MS分析，降解產物熒光性消失，表明AFB1被生物轉化成與其結構不同的物質，Ames誘變實驗表明地衣芽孢桿菌CFR1可以顯著降低AFB1的誘變性。Samuel等[57]發現惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）孵育24 h后將AFB1降解至檢測不到的水平，氣相色譜-MS和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析表明，AFB1分子是通過呋喃、內酯環的修飾和環戊烯酮環丟失，被轉化為結構不同且毒性較低的新化合物（AFD1、AFD2和AFD3）（圖7）。Eshelli等[58]發現紅平紅球菌菌株（Rhodococcus erythropolis ATCC 4277）對AFB1的降解率達96%，通過液相色譜-MS和FT-IR分析，鑒定出AFB1的降解途徑是經過脂肪酸代謝和糖酵解中間體的積累形成分子式為C13H16O4、摩爾質量為236.104 9 g/mol的芳香族化合物（圖8）。

圖7 惡臭假單胞菌對AFB1的降解機理[57]Fig. 7 Degradation mechanism of AFB1 by Pseudomonas putida[57]

圖8 紅平紅球菌ATCC 4277對AFB1的降解過程[58]Fig. 8 Degradation of AFB1 by Rhodococcus erythropolis ATCC 4277[58]

3.2.2.2 真菌發酵粗提液對AFB1的降解

真菌對AFB1降解作用的研究和應用同樣廣泛。劉大嶺等[59]發現從真菌假蜜環菌（Armillariella tabescens）中提取的胞內粗酶液可使樣品中的AFB1完全降解。Wang Cuiqiong等從發霉花生中分離出鐮刀菌WCQ3361（Fusarium phaseoli WCQ3361），與AFB1孵育24 h后降解率為95.38%，且有效成分是蛋白質，具有較好的熱穩定性，并通過人肝癌HepG2細胞的毒理學實驗證明降解產物毒性降低[60]。張曉雪[61]發現新型黑曲霉FS-UV1（Aspergillus niger FS-UV1）對AFB1的脫除率為87.3%，進一步研究表明其發酵液對AFB1有降解作用且脫毒反應可能是通過蛋白質作用，并通過動物實驗證明了該菌處理毒素后毒性降低。表2總結了對AFB1有脫毒功能的微生物，包括吸附和降解兩種機制。

表2 微生物對AFB1的脫毒情況Table 2 Microorganisms for the detoxification of AFB1

圖9 毒素產生真菌對AFB1的降解途徑[62]Fig. 9 Degradation pathway of AFB1 by toxin-producing fungi[62]

真菌不僅能產生毒素，而且能夠降解毒素（圖9）。Nakazato等[62]報道了4 種真菌菌株對AFB1的降解途徑，黑曲霉（Aspergillus niger）、草根霉（Eurotium herbariorum）、根霉屬（Rhizopus spp.）和產生非AFT的黃曲霉（Aspergillus flavus）通過還原AFB1的環戊烯酮羰基，可以將AFB1轉化為AFL-A，然后產生有機酸將其進一步轉化為AFL-B，并且AFL-A和AFL-B之間可以相互轉換。黑曲霉能夠將AFL轉化為AFB1，進一步轉換為AFB2a。另外，他們發現AFB1和AFL的含量隨時間的延長而減少，其降解率為98.6%，并提出兩種化合物都被代謝成其他未知物質，這有待于進一步研究。表3總結了對AFB1有降解功能的脫毒酶，包括氧化酶、過氧化酶、還原酶等。

表3 脫毒酶對AFB1的降解情況Table 3 Degradation of AFB1 by detoxification enzymes

4 結 語

本文主要總結了AFB1的毒性機理和微生物脫毒方法的研究概況。脫毒方法是預防AFB1污染的后期控制方法。利用微生物菌體本身或其產生的脫毒酶對AFB1有效脫毒來消除其危害是目前解決AFB1污染的有效途徑和研究熱點，近年來取得了一定的研究成果。目前的研究主要針對降解AFT菌株的篩選、鑒定和脫毒條件的優化，但對脫毒物質的分離、純化、降解產物的獲得以及其毒理學研究相對較少。AFT雖能被不同的菌株所降解，但存在菌株脫毒作用周期長、功能不穩定等問題。對AFT降解酶相關序列的研究較廣泛，但其產量、活性和穩定性均不盡人意。結合目前脫毒研究存在的問題、當代科學技術發展和對未來有效防控AFT污染手段的研究，提出幾點展望。

4.1 抑制產毒菌株生長的蛋白質的分離純化及其功能基因的獲得

利用微生物競爭來控制AFB1的污染是預防毒素危害的前期控制方法，其原理是通過與AFB1產毒菌爭奪營養物質和空間等作用來抑制其生長，從而降低毒素的產生。目前對于抑制產毒菌株生長的拮抗微生物研究廣泛。左瑞雨等[63]發現乳酸菌和枯草芽孢桿菌與黃曲霉共培養時能夠產生某種化學物質，對黃曲霉菌絲的生長有明顯的抑制作用。龔慶偉[64]對芽孢桿菌的抗菌物質進行分離、純化，發現了抗菌脂肽bacillomycin D，其屬于Iturin家族，是枯草芽孢桿菌依靠非核糖體合成途徑產生的減少AFB1的較強抗生素，對黃曲霉菌絲生長和孢子萌發都具有明顯的抑制作用。Wang Kai等[65]獲得的JPP1菌株產生的幾丁質酶能降解黃曲霉的細胞壁，其抑制參與AFT基因簇的aflR、aflC（pksL1）和aflO（dmtA）基因的轉錄。通過目視瓊脂平板實驗和尖端培養方法，JPP1菌株抗真菌率大于95%，抗真菌毒素發生率大于98%，抑菌效果明顯，可用于植物病原真菌和AFT的生物防治。

不產毒霉菌對產毒菌株同樣有抑菌作用。魏丹丹[66]研究了不產毒黃曲霉菌對產毒菌產毒的抑制效果，發現黃曲霉菌不產毒與2 個基因（aflR和nor-1）的表達顯著下調相關；且抑制效果的差異可能與產毒菌對谷物的侵染能力、菌核類型、競爭營養和空間的能力有關。其研究主要針對幾種具有抑菌作用的微生物，而抑菌物質的分離純化和抑菌蛋白功能基因序列的獲得仍然是今后研究的主要方向。

4.2 利用基因工程手段獲得雙價或多價酶產品或工程菌，實現對AFB1前后期有效防控

目前已經獲得了一些能有效降解AFB1的脫毒酶的核酸序列，在今后的研究中可以通過有效的基因修飾手段和高效的分離純化工藝，利用基因工程的手段實現大規模生產，有效實現AFB1的后期控制。為更好地預防AFB1的污染，必須做好AFB1產生前后的有效防護，因此，需要找到能夠有效抑制產毒菌株生長的抑菌劑，而抑菌蛋白的分離純化及其核酸序列的獲得能有效解決這一問題。功能蛋白/肽的獲得提高了脫毒作用的穩定性，避免了運用整個微生物的功能不穩定問題。目前已經有大量研究從植物、動物和微生物中提取具有抗真菌活性的蛋白，利用基因工程的手段大量生產抑菌蛋白，其在預防植物病原菌侵害方面的作用明顯[67-68]。因此，毒素降解蛋白和抑制產毒菌蛋白序列的獲得為今后進行兩個或多個功能基因融合表達載體的構建提供了依據，從而可能實現雙價效益，從根本上消除毒素危害。

4.3 利用分子生物學手段對產毒基因進行修飾和改造，培育出不產毒的轉基因作物產品

利用轉基因技術、敲除產毒基因或阻止產毒基因正常表達等手段培育出不產毒的轉基因作物成為田間的優勢品種，也是一種非常具有潛力的生物防治途徑。

AFT生物合成過程中至少存在25 步酶促反應，aflR、aflC、aflS等是AFT生物合成途徑的相關基因[28]。Thakare等利用寄主誘導的基因沉默的方法將AFT合成基因aflC的RNAi載體轉染到玉米中，生產出不被AFT污染的轉基因玉米[69]。采用基因工程技術制成可抑制或阻斷毒素合成基因正常表達的特效制劑，是防治AFB1的一種新型、高效的手段。另外，了解黃曲霉中次級代謝的信號分子以及調控、修飾因子，有助于了解AFT阻斷劑的新靶點，為開發新脫毒方法提供思路。Yang Kunlong等[70]系統地研究了高親和力的cAMP磷酸二酯酶H（phosphodiesterases H，PdeH）在調節黃曲霉生命活動中起的重要作用，發現PdeH顯著影響黃曲霉的生長、發育和AFT的生物合成，并證明了AFT信號分子與毒素合成的關系。隨后，Yao Guangshan等[71]獲得了黃曲霉中的所有APSES轉錄因子，其中，AfRafA和AfStuA是影響分生孢子和菌核的發育、植物種子定植、AFT基因簇表達和毒素合成所必需的轉錄因子，因此，其可作為植物育種或開發殺菌劑的潛在新靶點。Ren Silin等[72]揭示了賴氨酸琥珀?；谡{節黃曲霉代謝和AFT生物合成中的廣泛作用。因此，對AFT合成過程中酶的琥珀酰化位點的修飾將會是脫毒的創新方法。

利用生物化學、分子生物學、基因工程的手段對微生物或基因進行篩選及改造，并獲得高效表達的AFT脫毒酶產品、不產毒菌株并結合遺傳育種生產無毒糧食，實現脫毒技術產業化和規模化，能夠造福食品安全事業。另外，解決微生物法脫除霉菌毒素過程中周期普遍較長、在復雜環境下脫除能力不穩定等問題，生物脫毒技術將會具有更重要的實際應用價值。