蛋白組學在肝癌中的應用研究

袁佳慧

摘?要：近年來，人們在基因組學的研究上有了巨大的進展，如研究者利用宏基因組學克隆技術篩選獲得全新的功能基因和活性物質，大大促進了醫學和生物技術工程的快速房展以及人類基因組測序中每條染色體的DNA分子大小，包含的編碼基因、非編碼基因和假基因的數目，編碼基因的舉例。然而基因的表達是有選擇性的，生命體的所有生命現象都是由蛋白質去執行完成的，所以在人們對生命現象研究的過程中，蛋白質已經成為研究的熱點，而蛋白組學就是研究蛋白質的有力方法，因此蛋白組學已經成為研究的熱點。將通過查閱文獻的方式對蛋白組學在肝癌方面的研究方法及進展進行總結與展望。

關鍵詞：蛋白組學的研究;肝癌中的應用

中圖分類號：F24?????文獻標識碼：A??????doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2019.14.045

蛋白組學是指大規模研究蛋白質的特征，其中包括蛋白質的表達、修飾、蛋白質之間的相互作用等，由此獲得蛋白質水平上疾病發生的機理、細胞代謝等過程的認識的一門學科。近年來，隨著蛋白組學研究技術的不斷發展，蛋白組學已被應用于很多領域，例如在疾病研究中發現新的標志物、探索遺傳病的發病原因、為更快更好的研制藥物提供技術支持、對食品科學提供新思路，同時對于微生物界的研究也有很廣的應用。其中，蛋白組學應用于人類疾病的研究最為廣泛，例如的肝癌的研究。目前，肝癌是最常見的疾病，有較高的發病率，致死率很大，并且呈現上升趨勢。因此，有研究者將蛋白組學應用于肝癌的研究中。

1?蛋白組學技術

1.1?蛋白質的沉淀

蛋白質的分離技術在不斷地改進與創新中。研究蛋白質的分離可以為之后蛋白質的鑒定提供較優的原材料。現在常見的有鹽析法和有機溶劑沉淀法。而有機溶劑相比中性鹽來說，機溶劑沉淀法的分辨力和提純效果比鹽析法更好。

1.1.1?鹽析法

鹽析法是操作較為簡便的一種沉淀蛋白質的技術，將中性鹽加入在蛋白質溶液中，中性鹽將破壞蛋白質表面的水化膜來沉淀蛋白質。雖然操作簡便、可以保護蛋白質、適用范圍也較廣，但是它的缺點也很多，例如提純濃度不高，無法得到足夠純度的蛋白質。例如張煜先利用硫酸鹽鹽析法分級分離大豆酸沉蛋白，再用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行分析，最終得出了此方法操作簡單，可在短時間內使不同大小的酸沉蛋白沉淀出來。

1.1.2?有機溶劑沉淀法

有機溶劑沉淀法相比于鹽析法來說，分辨力更高一些，提純效果要更好一些。因為有機溶劑不僅可以破壞蛋白質表面的水合層，而且有機溶劑還可以使中性離子間的靜電引力增強，這樣蛋白質就會沉淀下來。但有機溶劑法仍不能得到足夠純度的蛋白質，需要后續的加工，另外蛋白質也易由變性，有機溶劑的極大使用也會帶來回收、儲存的麻煩。有機溶劑沉淀也廣泛的應用，如張恭勤，張一新，謝維剛等提取無蛹突蛋白質。將含有豐富蛋白質的蠶蛹曬干、破碎、去皮，再用有機溶劑反復沉淀蛋白質，得到了大量無蛹臭的白色蠶蛹蛋白質。

1.2?蛋白質的分離純化

蛋白質的分離技術是不斷改進和發展的，最開始利用簡單的離心技術，雖然能在一定程度上對物質進行分離，但僅利用物理方法無法實現蛋白質的徹底分離，分離后仍混有較多雜質，而蛋白質質譜技術要求較精確，所以蛋白質的分離技術不斷向更準確、更精確的方向發展。目前主要的分離技術有離心法，電泳法以及色譜技術等。

1.2.1?離心法

在這些技術中比較簡單的方法是離心法，離心技術是通過離心力來分級蛋白質。此方法雖操作簡便、快速，但無法完全分離各組分，如陳如梅等人應用離心的方法獲得球蛋白提取液。一般，離心法無法將物質完全分離，處理后產物仍混有較多雜質，需要在離心后采用其他技術進行進一步分離。

1.2.2?高效液相色譜法

高效液相色譜法的原理是用液體作為流動相搭配高壓輸液系統，在色譜柱中裝入混合溶劑，緩沖液等流動相。再抽離柱內成分后進行檢測，從而分離樣品，如高旭東利用高效液相色譜檢測黃芩苷，鹽酸小檗堿和大黃素;色譜法在目前能較好分離蛋白，并且具有較高的分離效率、分析速度、檢驗靈敏度和較少的樣品用量、較好的選擇性，易于自動化。張元梅等利用高效液相色譜法鑒定柑橘果實中18種類黃酮的含量時，說明了此方法的優缺點，缺點即不能進行相關蛋白質的具體檢測。

1.2.3?雙向電泳

同時利用蛋白質等電點和分子量的差異進行電泳分離的方法叫雙向電泳法，第一向是等電聚焦電泳，第二向是SDS—PAGE電泳。之后的蛋白質呈現二維分布，水平方向是蛋白質在等電點上的差異，垂直方向上是蛋白質分子量上的差異。這個方法具有高靈敏度和高分辨率，方便的圖像分析處理與質譜分析匹配的優點;但這種技術對于有些蛋白質還難于有效分離、梯度不穩定，并且膠內酶解過程即費時、又費力，又使這項技術難以實現自動化。例如沈飛英等人用雙向電泳技術研究家蠶催青前期的胚胎蛋白質，檢測到家蠶催青前期的467個蛋白質斑點。

1.3?蛋白質的鑒定

將蛋白質分離出來后，要對其進行鑒定。目前主要的蛋白質鑒定方法為和蛋白質質譜技術，下面將重點介紹這兩種方法。

1.3.1?雙向電泳

利用蛋白質等電點和分子量的差異進行電泳分離的方法叫雙向電泳法。雙向電泳的分離圖像可以對組織蛋白質表達的分子量和等電點等進行初步鑒定，并可以預測蛋白質點出現的位置。例如譚永梅等利用雙向電泳技術有效的分析了冠突散囊菌與veA基因相關的差異蛋白，更好的認識冠突散囊菌的產孢機理。

1.3.2?蛋白質質譜技術

質譜法分析蛋白質的原理是將蛋白質分子轉化為離子，在一定的電場與磁場的共同作用下將具有不同質荷比的蛋白質分離開來。此方法靈敏度高、操作簡便、準確性高、所需時間短的優點，但質譜儀的造價十分昂貴，使用成本高。例如張麗君等人利用多維色譜-串聯質譜聯用技術檢測出小鼠肝臟質膜蛋白質中的126種蛋白質，其中包括41種膜蛋白。

2?蛋白組學在肝癌研究中的應用

2.1?肝癌的起因

肝癌的發生是由于體內多種基因的共同變化所引起的，而基因轉錄的產物為蛋白質，蛋白質是人體生命活動的執行者，所以研究蛋白質的差異有利于對癌變的認識。如周海軍等將正常人的肝細胞系與肝癌細胞的肝細胞系進行對比，發現有12個蛋白質的糖基團發生改變，論證了蛋白質糖基團的改變在肝癌的發生中起著作用。因此，用蛋白組學對肝癌進行研究，可以使人們了解肝癌的起因，進而預防肝癌的發生。

2.2?肝癌的診斷

盡早確診肝癌對于肝癌患者的治療與康復十分重要。對肝癌的診斷主要是尋找其標志物。早期人們開始用甲胎蛋白作為其標志物，目前仍是使用最佳的標志物。但隨著研究蛋白組學技術的發展，對肝癌的其他標志物的研究也在不但深入。例如高爾基體73蛋白、肝癌生長因子、異常凝血酶原……

2.2.1?甲胎蛋白

甲胎蛋白屬于糖蛋白，在人體內的含量不高。甲胎蛋白與腫瘤的發生相關，它有許多功能：結合和轉運、維持血漿滲透壓。甲胎蛋白對于細胞的增長和抑制都起著作用。當甲胎蛋白超過一定的范圍后，肝癌發生的機率會很大。甲胎蛋白不僅可以檢測肝癌，同時也可以作為肝癌轉移與治療效果的指標。

2.2.2?高爾基體73蛋白

高爾基73蛋白在正常的人體中也存在，但其含量很低或者幾乎沒有，但在肝癌患者的體內含量較高。甲胎蛋白的敏感性較低，尤其是在肝癌轉移的方面。付超等人經實驗研究得出，高爾基體73蛋白的敏感性遠遠高于甲胎蛋白，具有很好的實用的臨床價值，在未來有可能成為人們診斷肝癌的新型標志物。

2.2.3?肝癌生長因子

肝癌生長因子是肝癌和它周圍血管生長的必需物質，屬于多肽類物質。隨著惡性腫瘤的形成和生長，肝癌生長因子會擴散到其周圍的血管里。高文斌等人發現手術前后惡性腫瘤的大小，甲胎蛋白和肝癌生長因子都有變化，并且肝癌生長因子的變化更為顯著，具有更高的敏感性。肝癌生長因子的較高的敏感性，使其可以診斷早期肝癌、判斷腫瘤大小。如果可以配合其他檢測肝癌的技術，會有更好的效果。

2.2.4?異常凝血酶原

近來越來越多的研究表明，異常凝血酶原具有相當的研究價值。殷正風等人經研究表明，當腫瘤的直徑大于或等于2.1cm時，異常凝血酶原的含量會隨之增加。因此，異常凝血酶原可以作為肝癌的標志物。

2.3?肝癌的轉移

肝癌患者死亡的主要原因是轉移和復發，肝癌的轉移和復發是患者長期生存和手術效果的最大的困難。目前，有的學者為了更深入的了解肝癌的轉移與復發，用蛋白組學進行研究。如孟春城等人研究檢測了血管內皮細胞生長因子等蛋白質，探究肝癌的轉移和復發的影響因素，得出了肝癌的轉移與復發與血管內皮細胞生長因子、尿激酶型纖溶酶原酶活物等蛋白質的表達無關。還有毛華等人研究了分裂原激活蛋白激酶p38信號傳導通路在抑制血管內皮細胞生長因子誘導肝癌轉移，得出了血管內皮細胞生長因子除了提供癌細胞增殖的營養外，還可以通過分裂原激活蛋白激酶p38信號引導癌細胞，導致肝癌的轉移。通過對比肝癌患者轉移前后體內蛋白質含量的差異，可以得出肝癌轉移的原因及影響因素。

2.4?肝癌的治療

肝癌目前的主要治療方法是外科手術切除，但因為肝癌患者在早期可能有轉移現象，再加上我國大多數肝癌患者在患肝癌的同時，伴有肝功能的下降，所以手術切除的作用并不完全。隨著蛋白組學的發展，其在肝癌的治療中也發揮著作用。例如Ding等運用蛋白組學技術，得出了一些差異蛋白質不僅可以作為肝癌診斷的標志物，還可以減弱肝癌轉移的能力，為肝癌的靶向性治療提供了研究基礎，提高肝癌治療的成功率。

3?總結與展望

隨著社會的發展，人們對蛋白質的研究技術也在不斷發展。質譜法會進一步突破，研究出使用成本較低的儀器;高效液相色譜可以定量分析蛋白質的差異表達，可以分離過酸或分子量過小的蛋白質。

蛋白組學也應用于細胞生物學、神經生物學、尋找疾病分子標記和藥物靶標等許多的方面，對肝癌的探究也日益深入。通過對比肝癌患者與正常人體內的差異蛋白，有助于研究肝癌的起因、轉移以及肝癌的治療方法，降低肝癌的發病率、提高治療的成功率。蛋白組學為肝癌的研究提供了一個全新且有力的平臺。研究不斷地創新，技術不斷發展。

現在，人們已經在肝癌的起因、診斷、轉移、治療的方面有了一些研究，找到了部分標記蛋白。在未來，可以利用蛋白組學找出具有更高敏感性的肝癌標志物，更早的發現肝癌患者，使其盡早接受治療，增加康復率;找到引起肝癌的轉移與復發的主要蛋白，研制出抑制此類蛋白質的藥物，防止肝癌患者的病情加重;將蛋白組學應用于臨床治療上，結合其他治療肝癌的技術，盡量彌補手術切除的缺陷，降低復發率。使肝癌不再是威脅人類生命的主要疾病。

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