Ras/Raf/MEK/Erk通路在慢性高原病骨髓紅系細(xì)胞中的作用及SAHA對(duì)其抑制效果的研究

馮萍珍 冀林華

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海 西寧 810001)

慢性高原病(CMS)是一種高原環(huán)境下機(jī)體長(zhǎng)期慢性缺氧繼發(fā)的紅細(xì)胞增多和細(xì)胞缺氧為特點(diǎn)的疾病。該病的病理生理機(jī)制尚不明確，有研究[1-3]認(rèn)為，因機(jī)體的長(zhǎng)期慢性缺氧誘發(fā)的低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)表達(dá)的增加，可促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等細(xì)胞因子的表達(dá)，最終導(dǎo)致CMS的發(fā)生。然而，有學(xué)者[4]認(rèn)為，EPO等細(xì)胞因子的上升水平與CMS發(fā)病之間缺乏有效的直接證據(jù)，這表明CMS的發(fā)病可能還有其他因素參與其中。Ras/Raf/MEK/Erk通路是真核細(xì)胞生物體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，該通路可將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[5-7]。目前該通路是否參與CMS發(fā)病過(guò)程尚無(wú)定論，筆者擬通過(guò)對(duì)CMS患者骨髓紅系細(xì)胞內(nèi)的節(jié)點(diǎn)基因及蛋白的定量分析予以明確。此外，有研究[8]發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰化狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的增殖存在顯著相關(guān)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可有效降低細(xì)胞內(nèi)的組蛋白乙酰化水平，從而降低細(xì)胞的增殖程度。SAHA是第二代組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有更高的去乙酰化活性[9]。筆者采用SAHA干預(yù)CMS患者骨髓紅系細(xì)胞，以明確其對(duì)紅系細(xì)胞過(guò)度增殖的抑制情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年12月至2017年12月我院血液科收治的明確診斷為CMS患者23例為觀察組，其中男15例，女8例，年齡31～48歲，平均(37.21±5.03)歲。另選擇同期年齡匹配的健康體檢者10名為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2004年版國(guó)際青海標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)CMS的診斷標(biāo)準(zhǔn)。受試者均征得本人知情同意，本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性紅細(xì)胞增多癥；慢性肺源性心臟病；慢性阻塞性肺病；其他原因?qū)е碌穆匀毖跣约膊〉取山M受試者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與儀器 試劑：IMDM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)HyClone公司)，CD71、CD235a抗體(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，人Ras-GTP ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)RB公司)，鼠抗人p-ERK1/2單克隆抗體(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人p-BRaf單克隆抗體(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人p-MEK單克隆抗體(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自江蘇碧云天公司)，引物合成(上海生工公司)。儀器：ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光PCR儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司)，流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司)，SYSMEX XS-500i全自動(dòng)五分類血球計(jì)數(shù)儀(購(gòu)自日本SYSMEX公司)。

1.3方法

1.3.1骨髓有核紅細(xì)胞的采集、分離與培養(yǎng) 征得受試者同意后，于髂后上嵴抽取患者骨髓液10 mL，采用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞。采用CD71及CD235a抗體磁珠分離骨髓有核紅細(xì)胞。將分選的有核紅細(xì)胞富集至1×106個(gè)/L并培養(yǎng)于IMDM體系中，于37 ℃、5% CO2、3% O2的低氧環(huán)境下培養(yǎng)72 h。將觀察組患者所培養(yǎng)細(xì)胞分為5組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×104個(gè)/mL的密度接種于 96 孔板 ，每孔100 μL細(xì)胞懸液。SAHA 處理濃度分別為0.5、1、2、3、5 μmol/L。每一個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別處理12、24、48 h，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)結(jié)束后加0.5% MTT，4 h后加入細(xì)胞裂解液。次日于540 nm波長(zhǎng)下讀取各孔OD值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞存活率 =(加藥組細(xì)胞 OD平均值/正常細(xì)胞 OD平均值) ×100%。

1.3.2骨髓有核紅細(xì)胞分泌Ras-GTP水平的測(cè)定 收集有核紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清(800 r/min離心)，采用ELISA法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并量化Ras-GTP分泌水平，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3骨髓有核紅細(xì)胞中BRaf、MEK、ERK1、ERK2Mrna水平的檢測(cè) 收集培養(yǎng)后的有核紅細(xì)胞，采用TRIZOL試劑分解細(xì)胞并提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成Cdna。以β-catin為內(nèi)參基因，采用ABI 7300型PCR儀將轉(zhuǎn)錄成的cDNA在50 ℃、2 min，95 ℃、15 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)條件下擴(kuò)增。每次循環(huán)均設(shè)空白對(duì)照，計(jì)算目的基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù) 3 次取均值。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定。基因相對(duì)表達(dá)量采用△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)觀察組-(Ct目的基因-Ctβ-catin)對(duì)照組，觀察組標(biāo)本相對(duì)表達(dá)量為2-△△Ct。引物序列見表1。

表1 引物序列

注：F為正義鏈；R為反義鏈。

1.3.4骨髓有核紅細(xì)胞中BRaf、MEK、ERK1、ERK2蛋白水平的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)，各組培養(yǎng)的有核紅細(xì)胞加細(xì)胞裂解液后取總蛋白50 μL樣本進(jìn)行變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至NC膜上過(guò)夜；漂洗后，4 ℃下于NC膜上加入一抗，結(jié)合4 h；再漂洗，分別與各自二抗結(jié)合，4 ℃，2 h。結(jié)束后采用ECL顯影試劑盒顯影。預(yù)染Marker顯示蛋白質(zhì)分子量，利用Quantity One軟件等高線測(cè)量法檢測(cè)，不同時(shí)點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5外周血血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞比容(HCT)及血氧飽和度檢測(cè) 采用SYSMEX XS-500i全自動(dòng)五分類血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)受試者外周血Hb、HCT水平。采用指套式電傳感器檢測(cè)受試者血氧飽和度。

2 結(jié) 果

2.1兩組骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP、BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達(dá)水平間差異 骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP的表達(dá)水平采用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示，觀察組患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP水平(22.21±4.31) pg/mL較對(duì)照組(18.35±5.08) pg/mL顯著增高(t=5.973，P<0.01)。骨髓有核紅細(xì)胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達(dá)水平采用qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，觀察組患者骨髓有核紅細(xì)胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組患者骨髓有核紅細(xì)胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達(dá)水平間比較

2.2SAHA對(duì)CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 與未經(jīng)藥物處理的CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度的SAHA處理后，CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞增殖受到了明顯抑制(見圖1)；且SAHA對(duì)細(xì)胞的殺傷作用呈時(shí)間和劑量依賴性(見圖2)；而SAHA對(duì)細(xì)胞的最佳殺傷濃度為2 μmol/L，作用時(shí)間為48 h，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用此條件下進(jìn)行。

圖2 不同時(shí)間及劑量下CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞對(duì)SAHA敏感性實(shí)驗(yàn)

2.3SAHA對(duì)CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 在SAHA濃度為2 μmol/L時(shí)，細(xì)胞殺滅作用最為明顯。故采用ELISA法檢測(cè)在SAHA為該濃度下不同時(shí)點(diǎn)CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP濃度，結(jié)果顯示為0 h(19.03±3.36) pg/mL、12 h(18.86±4.29) pg/mL、24 h(19.29±3.64) pg/mL、48 h(19.11±2.58) pg/mL。各時(shí)點(diǎn)間Ras-GTP濃度未見顯著差異(F=0.339，P>0.05)。采用Western Blot法檢測(cè)BRaf、MEK及ERK1/2等蛋白表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，MEK蛋白在不同時(shí)點(diǎn)間未見明顯差異(P>0.05)；而BRaf及ERK1/2蛋白在不同時(shí)點(diǎn)間存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

表3 SAHA為2 μmol/L濃度下不同時(shí)點(diǎn)ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路是有核細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的信號(hào)通路之一，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理功能均有明顯的調(diào)節(jié)作用[10]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路中各重要節(jié)點(diǎn)蛋白/基因在CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞中均顯著表達(dá)，這是因?yàn)镽as/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路在CMS發(fā)病過(guò)程，通過(guò)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)異常活化，即上游激活蛋白激活MAPK激酶的激酶(MAPKKK)，此后繼續(xù)激活MAPK激酶(MAP-KK)，最終活化MAPK。在ERK通路中，Ras扮演上游激活蛋白的角色，Raf作為MAPKKK可激活MAPK/ERK激酶(MEK)，在此過(guò)程中，MEK相當(dāng)于作為MAPKK，而ERK即MAPK[11-14]。本研究通過(guò)SAHA干預(yù)CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞結(jié)果顯示，在2 μg/mL濃度下作用的抑制效應(yīng)最為明顯，而且Raf及ERK相關(guān)蛋白隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平明顯降低，這提示SAHA對(duì)CMS患者骨髓中紅系細(xì)胞具有顯著的抑制作用，而這一作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)通路中相關(guān)蛋白下調(diào)實(shí)現(xiàn)的。除ERK通路介導(dǎo)的細(xì)胞增殖之外，組蛋白去乙酰化水平目前也認(rèn)為與細(xì)胞的增殖存在密切相關(guān)，組蛋白的乙酰化水平對(duì)基因的表達(dá)起到了顯著的干預(yù)作用，當(dāng)組蛋白處于乙酰化狀態(tài)時(shí)，由DNA雙鏈與組蛋白構(gòu)成的核小體其結(jié)構(gòu)逐漸松散，大大提高了各種轉(zhuǎn)錄因子與目的基因的結(jié)合概率，從而導(dǎo)致相關(guān)蛋白表達(dá)水平的增加。而當(dāng)組蛋白去乙酰化后，核小體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得DNA的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。這一發(fā)現(xiàn)已在多種腫瘤性疾病中得以驗(yàn)證，通過(guò)采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑干預(yù)組蛋白去乙酰化過(guò)程可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15-16]。SAHA是第二代組蛋白去乙酰化抑制劑，與第一代相比，其具有更高的抑制去乙酰化效果。

綜上所述，Ras/Raf/MEK/Erk通路的異常激活可能參與了CMS的發(fā)病過(guò)程，SAHA可有效抑制CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與下調(diào)BRaf及ERK1/2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。然而，由于受到樣本量等客觀因素的限制，數(shù)據(jù)偏倚在所難免，后續(xù)需進(jìn)一步深入研究。