鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二辛酯對大黃魚受精卵及仔魚的急性毒性效應(yīng)

李 磊，蔣 玫，王云龍

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

鄰苯二甲酸酯（phthalic esters，PAEs）是一類重要的工業(yè)用有機(jī)化合物，作為工業(yè)生產(chǎn)中塑料、樹脂、橡膠等的增塑劑可以增強(qiáng)產(chǎn)品的可塑性和韌性，同時(shí)也可以作為農(nóng)藥載體以及其它化工產(chǎn)品的生產(chǎn)原料［1］。我國每年的PAEs消耗量超過一百萬噸［2］。PAEs具有很低的水溶性，但易溶于有機(jī)溶劑，對固體顆粒、生物體表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸附性和親和性，PAEs在塑料中以范德華力和氫鍵與其它材料相結(jié)合，結(jié)構(gòu)松散，作用力小，可由塑料制品中擴(kuò)散至外界環(huán)境，而廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中［3-4］。研究表明，在大氣、水體、土壤等自然環(huán)境以及生物乃至人體中普遍發(fā)現(xiàn)PAEs的存在，在全球主要工業(yè)國家環(huán)境中PAEs均達(dá)到普遍檢出的程度，其已成為一類全球性最普遍的有機(jī)污染物［5］。美國環(huán)境保護(hù)署（U．S Environmental Protection Agency，EPA）將其中的鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯 （diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯 （dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二辛酯 （dinoctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（butyl benzyl phthalate，BBP）和鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）列為優(yōu)先控制污染物［6］，我國也將其中的 DMP、DBP和 DEHP列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物［7］。眾多研究均表明，DBP、DOP對水生生物具有一定的毒性，DBP能影響大型溞（Daphnia magna）的捕食行為與繁殖［8-10］；對斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、短裸甲 藻 （Gymnodinium breve）、三 角 褐 指 藻（Phaeodactylum tricornutum）等微藻的生長均有抑制作用［11-12］；對斑馬魚 （Danio rerio）［13-14］、紅鰭笛 鯛 （Lutjanus erythropterus）［15］、鯉 （Cyprinus carpio）［16］等魚類均具有一定的毒性效應(yīng)。DOP對鯉［17-18］等魚類生理生態(tài)及遺傳均有一定的影響。但目前還未見 DBP、DOP對大黃魚（Larimichthys crocea）毒性效應(yīng)影響的研究。

本研究選擇中國東海重要的經(jīng)濟(jì)魚類大黃魚作為受試生物，開展DBP、DOP對大黃魚早期發(fā)育階段的急性毒性效應(yīng)研究，旨在揭示鄰苯二甲酸酯對水生生物的毒性效應(yīng)和機(jī)制，為相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用海水從自然海區(qū)抽取，鹽度為21，pH為8．1，進(jìn)行沉淀和砂濾，充分曝氣（24 h以上）后備用，實(shí)驗(yàn)對象魚卵來自江蘇省海洋與水產(chǎn)研究所育苗場的大黃魚親魚（體長約為45 cm）的自然排卵，初孵仔魚由同一批受精卵孵化。

1．2 實(shí)驗(yàn)?zāi)敢旱闹苽?/h3>

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）（CAS：84-74-2）和鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）（CAS：117-81-7）均購于Sigma-Aldrich公司，用分析純丙酮作為助溶劑（體積比＜0．1%）配置DBP、DOP儲存液，儲存液進(jìn)一步稀釋至指定暴露濃度。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

大黃魚魚卵96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)：以1 L的低型燒杯為容器。在每個(gè)燒杯中投入約100個(gè)未孵化的受精卵（4細(xì)胞分裂期，卵徑為0．9 mm）。控制實(shí)驗(yàn)溫度為18℃左右，pH為8．1，并保持實(shí)驗(yàn)用水溶解氧為飽和溶氧的60%以上。采用靜態(tài)法進(jìn)行孵化實(shí)驗(yàn)。每間隔12 h在顯微鏡下觀察并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每間隔24 h換100%同等濃度的溶液，記錄實(shí)驗(yàn)期間胚胎出現(xiàn)的死亡率、孵化率、心率以及一些形態(tài)學(xué)上的畸形等。當(dāng)用顯微鏡觀察到任一組魚卵破膜仔魚時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，DBP和DOP分別按等對數(shù)間隔設(shè)置5個(gè)濃度組（DBP：6．67、3．73、1．87、0．93、0．47 mg·L-1；DOP：26．67、13．33、6．67、3．33、1．67 mg·L-1），同時(shí)以自然海水為對照組，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行樣。

大黃魚初孵仔魚96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)：在每個(gè)1 L燒杯中放入30尾仔魚，每天換水1次，期間不投喂。分別于實(shí)驗(yàn)后24、48、72、96 h觀察記錄大黃魚仔魚中毒及死亡情況。DBP和DOP分別按等對數(shù)間隔設(shè)置 6個(gè)濃度組（DBP：8．00、6．67、4．00、3．73、2．67、1．87mg·L-1；DOP：26．67、13．33、6．67、3．33、1．67、0．83 mg·L-1），同時(shí)以自然海水為對照組，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行樣。

同時(shí)設(shè)置大黃魚魚卵、初孵仔魚丙酮溶液試驗(yàn)組，結(jié)果表明丙酮添加對大黃魚魚卵的死亡率、孵化率無影響，對初孵仔魚的死亡率無影響。

1．4 數(shù)據(jù)處理方法

利用SPSS16．0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用概率單位算法，求得回歸方程并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，計(jì)算半致死濃度LC50及95%置信區(qū)間。根據(jù)公式SC＝96 h LC50×0．1，推算出安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2．1 DBP和DOP對大黃魚魚卵的影響

圖1 DBP和DOP對大黃魚魚卵孵化率的影響曲線Fig．1 Hatching rate of fish eggs of P．crocea in solutions with different DBP and DOP concentrations

不同暴露濃度下，DBP和DOP對大黃魚魚卵的孵化率有顯著不同的影響（圖1）。大黃魚魚卵的孵化率隨DBP和DOP濃度上升而下降，均顯示出負(fù)相關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系。同一孵化率水平的情況下，DBP的濃度低于DOP。

不同暴露濃度下，DBP和DOP對大黃魚魚卵的死亡率也有顯著不同的影響（圖2）。大黃魚魚卵的死亡率均隨DBP和DOP濃度上升而升高，顯示出正相關(guān)的劑量效應(yīng)關(guān)系。同一死亡率水平的情況下，DBP的濃度低于DOP。

2．2 DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的急性毒性及安全性評價(jià)

不同暴露濃度下，DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的96 h急性毒性致死率有顯著不同的影響（圖3）。隨著DBP和DOP暴露濃度的升高，大黃魚初孵仔魚死亡率逐漸升高，二者劑量效應(yīng)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的96 h LC50存在差異（表 1），DOP的 96 h LC50（6．57 mg·L-1）高于 DBP（5．23 mg·L-1），且 DOP的安全濃度（0．66 mg·L-1）也高于 DBP（0．52 mg·L-1）。表明DBP對大黃魚初孵仔魚的致死毒性要高于DOP。

圖2 DBP和DOP對大黃魚魚卵死亡率的影響Fig．2 Acute mortality rate of Pseudosciaena crocea fish eggs in solutions with different DBP and DOP concentrations

圖3 DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的96 h急性致死率Fig．3 Acute mortality rate of P．crocea larvae in solutions with different DBP and DOP concentrations

表1 DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的半致死濃度Tab．1 96 h LC50 values of DBP and DOP to P．crocea

依據(jù)國家環(huán)保局的“水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）”［11］中的魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)（表2），可以看出DBP和DOP對大黃魚初孵仔魚的危害等級屬于高毒毒性，且毒性DBP＞DOP。

2．3 DBP和DOP對大黃魚魚卵和初孵仔魚的鏡檢結(jié)果

對暴露在DBP和DOP溶液里的大黃魚魚卵和初孵仔魚進(jìn)行顯微鏡鏡檢，可以發(fā)現(xiàn)，高濃度試驗(yàn)組魚卵發(fā)育出現(xiàn)異常。與對照組相比（圖4-a），原本光滑的魚卵細(xì)胞表面出現(xiàn)了一些包狀突起，卵膜損傷，胚體皺縮，尾部畸變，停止發(fā)育，甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象（圖4-b）。與對照組（圖4-c）相比，處于出膜時(shí)期的大黃魚魚卵在高濃度DBP和DOP的暴露組出現(xiàn)畸形（圖4-d），初孵仔魚毒性表現(xiàn)為仔魚卵黃囊水腫、脊椎畸形，尾椎彎曲。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DBP和DOP對大黃魚魚卵和初孵仔魚均具有一定的毒性效應(yīng)，但兩者的毒性效應(yīng)存在差異。同一種鄰苯二甲酸酯類化合物對不同魚類的毒性相差也較大（表3）。本實(shí)驗(yàn)中DBP對大黃魚仔魚的96 h LC50為5．23 mg·L-1，低于虹鱒（Salmo gairdneri）的 6．47 mg·L-1［19］、紅鰭笛鯛的 6．66 mg·L-1［15］、斑馬魚的 9．67 mg·L-1［15］，但高于斑點(diǎn)叉尾鮰的 2．91 mg·L-1［19］。本實(shí)驗(yàn)中 DOP對大黃魚仔魚的 96 h LC50為 6．57 mg·L-1，低于鯉的 7．95 mg·L-1［18］，也低于斑馬魚的 9．89 mg·L-1［20］。這種毒性的差異一方面與魚類的種類、魚類所處發(fā)育階段有密切關(guān)系，比較文獻(xiàn)［20］和［21］可以發(fā)現(xiàn)，DBP對斑馬魚胚胎階段的96 h LC50高于斑馬魚幼體，說明了魚類早期發(fā)育階段對毒性物質(zhì)的暴露更加敏感；另一方面，不同種類的鄰苯二甲酸酯類化合物由于其自身結(jié)構(gòu)的差異，對魚類的毒性效應(yīng)也有差異。STAPLES等［21］研究了不同鄰苯二甲酸酯類化合物對大型溞的急性毒性，DMP毒性最小，其次是DEP和DBP，同時(shí)指出鄰苯二甲酸酯類化合物側(cè)鏈上的碳鏈越長，其毒性越大。何秀婷等［22］研究了 DMP、DEP、DBP和DEHP對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，結(jié)果也顯示了4種鄰苯二甲酸酯類化合物的毒性各不相同（DBP＞DEHP＞DEP＞DMP），結(jié)論也是碳鏈越長，對斑馬魚胚胎的毒性越大。

表2 魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)［11］Tab．2 Fish acute virulence classification standard

圖4 大黃魚魚卵和初孵仔魚的鏡檢結(jié)果Fig．4 Microscopic examination results of fish eggs and first hatched larvae of P．crocea

表3 DBP和DOP對其魚類的急性毒性Tab．3 Acute toxicities of DBP and DOP to some fishes

胚胎的孵化率對環(huán)境因子反應(yīng)敏感，有重要的生物學(xué)意義，常作為一種毒理學(xué)研究的指標(biāo)。DBP和DOP對大黃魚魚卵和初孵仔魚的毒性效應(yīng)差異也體現(xiàn)在對其的致畸效應(yīng)上，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低濃度DBP和DOP對大黃魚魚卵的孵化率影響不明顯，但高濃度DBP和DOP對胚胎發(fā)育產(chǎn)生較嚴(yán)重的畸形效應(yīng)，孵化率有所降低，甚至出現(xiàn)孵化仔魚死亡的現(xiàn)象。這與DBP和DOP對大黃魚魚卵和初孵仔魚的96 h LC50結(jié)果是一致的。其機(jī)理可能是賴胺酰氧化酶（LOX）的活性被抑制［24］，導(dǎo)致發(fā)生基因突變［25］。目前全球地表水中 PAEs一般為 μg·L-1級［26］，匯入海洋中可能會(huì)被進(jìn)一步稀釋，對海洋生物的急性毒性影響較小，但其對海洋生物的富集及慢性毒性效應(yīng)需要進(jìn)一步研究。