SIRT1、NF-κB在兒童支氣管哮喘中的作用

趙文峰，黃先杰

哮喘為呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)慢性疾病，臨床表現(xiàn)為氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和吸入性抗原引起的可變氣流阻塞[1]。哮喘可能來(lái)自各種致病因子，其分子機(jī)制尚未明確[2]。SIRT1(silent information regulator 1,SIRT1)屬于sirtuin蛋白質(zhì)家族，并已被證明可介導(dǎo)多種細(xì)胞事件，包括壽命延長(zhǎng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥[3]。由于哮喘是一種炎癥性疾病，而SIRT1在生理和病理過(guò)程中具有抗炎作用，而且也可以修飾很多非組蛋白，包括對(duì)NF-κB的去乙酰化作用參與到NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)中[4]。因此，SIRT1對(duì)哮喘的發(fā)生和進(jìn)展具有重要意義。本研究重點(diǎn)探討SIRT1/NF-κB信號(hào)通路中SIRT1和NF-κB表達(dá)水平，分析其與哮喘發(fā)病的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年1月至2018年1月在我院接受治療的41例哮喘患兒為觀(guān)察組，其中男27例，女14例。年齡3～13(5.84±1.37)歲，均符合兒童支氣管哮喘診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]，1周內(nèi)均未接受激素類(lèi)藥物的治療，排除合并鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、異物以及其他慢性疾病者。來(lái)我院參加體檢的健康兒童為對(duì)照組，共40例。無(wú)近期感染病史，無(wú)個(gè)人和家族過(guò)敏性疾病史，男25例，女15例，年齡3～13(5.68±1.31)歲。兩組患兒的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 樣本采集及指標(biāo)檢測(cè)患兒入院抽取靜脈血6 mL，分成3份，每份2 mL。其中一份Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置入液氮罐中保存?zhèn)溆茫涣硪环? 000 r·min-1離心10 min，留取血清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清IL-6水平，試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號(hào)PI330)；第三份置EDTA-K2釆血管內(nèi)，進(jìn)行Eos計(jì)數(shù)。

1.3 肺功能指標(biāo)檢測(cè)采用德國(guó)耶格小兒肺功能儀檢測(cè)第一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、第一秒用力呼氣量/用力肺活量(forced expiratory volume in 1 second /forced vital capacity,FEV1/FVC)、用力呼氣中期流量(forced expiratory flow,FEF)25%～75%、FEF50%、FEF75%；同時(shí)檢測(cè)呼出氣NO(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)，呼出流速控制在50 mL·s-1。每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3次，計(jì)算平均值。測(cè)量前詳細(xì)告知兒童及家長(zhǎng)注意事項(xiàng)，測(cè)量前行容積校準(zhǔn)，4歲以上1～3 L定標(biāo)筒，3歲以下為100 mL定標(biāo)筒。配合較差的可口服水合氯醛30～50 mg·kg-1，鎮(zhèn)靜催眠。

1.4 SIRT1、NF-κB mRNA的表達(dá)Trizol法提取PBMC總RNA，按照試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。采用Agilent M×3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Diagnostics，德國(guó))，上海英駿公司合成引物序列。SIRT1(NM_001314049.1)上游序列：5′-ACACAAAATCCAGCAACTCAGC-3′，下游序列：5′-TCCTTTGGATTCCCGCAACC，產(chǎn)物217 bp；NF-κB(Z22949.1)上游序列：5′-GTGTTTCACAC-ACGCACCAG-3′ ，下游序列：5′-ACCCCCTTCCTCC-TATTCAGG-3′T，產(chǎn)物302 bp；β-actin(DQ407611.1)上游序列：5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ ，下游序列：5′-CTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3′，產(chǎn)物163 bp。采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

2 結(jié)果

2.1 肺功能指標(biāo)比較觀(guān)察組的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%較對(duì)照組顯著降低，F(xiàn)eNO較對(duì)照組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 肺功能指標(biāo)各組檢測(cè)結(jié)果

注：FEV1：第一秒用力呼氣量；FVC：用力肺活量；FEF：用力呼氣中期流量；FeNO：呼出氣一氧化氮。

2.2 兩組IL-6和Eos水平比較觀(guān)察組的Eos、IL-6水平較對(duì)照組均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 IL-6和Eos水平各組檢測(cè)結(jié)果

注：Eos :外周血嗜酸性粒細(xì)胞;IL-6:白細(xì)胞介素-6。

2.3 PBMC中SIRT1、NF-κBmRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較，外周血單核細(xì)胞中觀(guān)察組SIRT1 mRNA水平明顯降低，NF-κBmRNA水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 SIRT1、NF-κB mRNA的表達(dá)

2.4SIRT1、NF-κBmRNA的相關(guān)性分析SIRT1 mRNA的表達(dá)與FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FE 75%呈正相關(guān)(P<0.05)，與FeNO、IL-6和Eos呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；NF-κBmRNA的表達(dá)與FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FEF75%呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與FeNO、IL-6和Eos呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 SIRT1、NF-κB mRNA的相關(guān)性分析

3 討論

在本研究中，觀(guān)察組SIRT1 mRNA水平明顯降低，NF-κBmRNA水平明顯增加，提示SIRT1能調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并參與調(diào)控包括NF-κB等眾多炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。而且SIRT1能使NF-κB去乙酰化，抑制NF-κB的過(guò)度激活，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)基因的表達(dá)[6]，這也可能與兒童哮喘的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

SIRT1也稱(chēng)為NAD-去乙酰化酶，屬于sirtuin蛋白家族的一個(gè)成員[7-8]。SIRT1已被證明可介導(dǎo)多種細(xì)胞事件，包括壽命延長(zhǎng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞侵襲和炎癥[9-10]。由于哮喘是一種炎癥性疾病，已有一些學(xué)者研究了SIRT1在哮喘的生理和病理過(guò)程中的作用[11]。Ichikawa T等發(fā)現(xiàn)，在OVA致敏和攻擊小鼠中，與鹽水致敏和攻擊小鼠(對(duì)照小鼠)相比，肺中Sirt1mRNA表達(dá)明顯降低，而細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道嗜酸粒細(xì)胞和支氣管肺泡灌洗(BAL)白細(xì)胞介素IL-4、IL-5和IL-13的水平增加，這表明了抗炎作用[12]。此外，Wang Y等還證實(shí)了OVA致敏小鼠肺組織中的SIRT1表達(dá)減少[13]。本研究結(jié)果顯示，哮喘患兒的SIRT1水平較對(duì)照組明顯下調(diào)，并與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，而與炎癥介質(zhì)及FeNO呈負(fù)相關(guān)。這些提示SIRT1與哮喘兒童的氣道炎癥及反應(yīng)性存在一定的聯(lián)系，可能參與了哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。值得注意的是，SIRT1參與了催化NF-κB的去乙酰化，抑制其炎癥功能[14]。NF-κB被鑒定為SIRT1發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵效應(yīng)物，其可通過(guò)調(diào)節(jié)表達(dá)水平發(fā)揮對(duì)應(yīng)的功能。而SIRT1可以與NF-κB相互作用，負(fù)性調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)，從而調(diào)控增殖、凋亡、代謝等[15]。本研究結(jié)果顯示，哮喘患兒的NF-κB水平較對(duì)照組明顯升高，并與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，與炎癥介質(zhì)及FeNO呈正相關(guān)。這也說(shuō)明SIRT1可與NF-κB相互作用，并負(fù)性調(diào)控下游IL-6的水平，同時(shí)也提示SIRT1可通過(guò)去乙酰化調(diào)控NF-κB表達(dá)，抑制炎癥水平，延緩哮喘的進(jìn)展。

總之，下調(diào)哮喘患兒SIRT1表達(dá)，能抑制NF-κB去乙酰化，并促進(jìn)IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。這些也表明，SIRT1激活可能是治療兒童哮喘的潛在靶點(diǎn)。