河南地區EICU革蘭陰性菌感染的分布及耐藥性、耐藥基因分析

荊 楠，閆文娟，楚亞菲，馬 冰，馬 瓊，李 軼

急診重癥監護病房(emergency intensive care unit, EICU)是感染的高發科室，由于患者病情危重、病因復雜、免疫力低、接受有創操作較多且大量應用抗生素，細菌分布和耐藥情況不同于其他病房。因此，了解特定病原菌分布尤其是不同標本中的分布及耐藥性情況顯得尤為重要。研究表明，EICU感染病原菌多為革蘭陰性桿菌[1]，而目前基于標本類型及耐藥基因分析EICU感染革蘭陰性菌分布及耐藥性的報道較少。本研究對河南地區4家醫院2014年1月至2017年12月EICU發生感染患者的送檢標本中分離出的革蘭陰性菌的分布、耐藥性及耐藥基因進行回顧性分析，為臨床合理應用抗菌藥物、醫院感染的預防控制提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料來自2014年1月至2017年12月河南地區4家醫院，包括河南省人民醫院、平頂山市第二人民醫院、新鄉市第二人民醫院、駐馬店市中心醫院EICU的感染患者共1 904例，年齡18～93(52.33±5.84)歲。從送檢的各類標本中培養分離出非重復病原菌1 240株，其中革蘭陰性桿菌828株。分離出的828株革蘭陰性菌中，河南省人民醫院427株，平頂山市第二人民醫院110株，新鄉市第二人民醫院132株，駐馬店市中心醫院159株。入選菌株標準為首次入住EICU的臨床診斷為感染患者的標本中培養出的細菌，同一病人同一標本類型培養出的相同菌株除首次培養外均剔除。

1.2 方法嚴格參照《全國臨床檢驗操作規程》第4版規定進行培養，分離病原菌；細菌鑒定采用美國BD Phonix100，法國梅里埃VITEC 2 Compact，珠海美華MA120型細菌鑒定儀；藥物敏感試驗采用紙片法、MIC法或E-test法。試驗方法與判定標準按美國臨床實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)2017年版的規定。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212等，均由原衛生部臨床檢驗中心提供。采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapene-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的耐藥基因blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48。

1.3 CRKP耐藥基因檢測對感染患者首次檢測出的非重復CRKP進行基因擴增。加熱煮沸法提取細菌DNA，擴增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM。反應體系依照Fermentas公司推薦條件進行。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview 1型染色劑染色后觀察結果。PCR擴增引物見表1。

表1 PCR擴增引物

1.4 統計分析使用WHONET 5.6軟件進行藥物敏感性結果的統計分析。應用SPSS 19.0統計軟件對計數資料進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標本來源及病原菌分布從EICU感染患者送檢的標本中共分離出病原菌1 240株，其中革蘭陰性桿菌最多，共828株，占66.77%。檢出革蘭陰性桿菌的標本來源中，痰及灌洗液比例最高(61.11%，506/828)，其次依次為血液(14.73%，122/828)；尿液(5.31%，44/828)；無菌體液(5.07%，42/828)；傷口分泌物(4.47%，37/828)及其他(9.30%，77/828)。革蘭陰性菌中前5位分離株依次為鮑曼不動桿菌(33.82%，280/828)；肺炎克雷伯菌(24.15%，200/828)；大腸埃希菌(13.04%，108/828)；銅綠假單胞菌(9.06%，75/828)；洋蔥伯克霍爾德菌(6.04%，50/828)。下呼吸道標本中首位分離株為鮑曼不動桿菌，而血液標本中病原菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主，尿液標本中大腸埃希菌占大多數，見表2。

2.2 革蘭陰性菌耐藥率非發酵菌中鮑曼不動桿菌除對替加環素、多黏菌素B耐藥率較低外，對其他藥物的耐藥率均很高；銅綠假單胞菌對多數抗菌藥物如阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶等表現出較好的敏感性；洋蔥伯克霍爾德菌對頭孢他啶、氯霉素和復方新諾明耐藥率低。腸桿菌科細菌對青霉素類、一代頭孢菌素、喹諾酮類抗生素的耐藥率較高，均超過55%。大腸埃希菌對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、替加環素及多黏菌素B敏感性較高。肺炎克雷伯菌對美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別達到39.00%和37.50%，對頭孢菌素類抗生素耐藥率均超過60%，革蘭陰性菌耐藥性見表3。

表2 不同類型標本革蘭陰性菌分布 株數(%)

表3 革蘭陰性菌對抗菌藥物的耐藥性 株數(%)

2.3 CRKP構成比及碳青霉烯酶耐藥基因檢測CRKP構成比從2014年的13.33%(4/30)升高至2015年的47.72%(21/44)，2016年達到高峰的50.00%(36/72)，差異有統計學意義(P=0.002，χ2=12.620)。采取有效感染控制措施后，2017年下降至35.19%(19/54)。呼吸道標本共檢出肺炎克雷伯菌126株，其中CRKP 67株，比例高達53.17%，而血液標本CRKP比例最低，為5.88%(2/34)，尿液、無菌體液等其他標本中CRKP為27.50%(11/40)。不同標本類型CRKP差異有統計學意義(P<0.001，χ2=28.207)。PCR方法檢測80株CRKP的耐藥基因blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48，67株攜帶blaKPC，6株攜帶blaNDM，2株攜帶blaIMP，其中1株細菌同時攜帶blaKPC和blaNDM。在所有耐藥菌株中未檢測到blaOXA-48和blaVIM。其碳青霉烯酶的分布見表4。

表4 CRKP中不同碳青霉烯酶的分布 例(%)

注：①一株肺炎克雷伯菌含有兩種耐藥基因。

3 討論

研究表明，EICU感染最常見的病原菌是革蘭陰性桿菌[1]。本研究共分離出病原菌1 240株，其中66.77%為革蘭陰性桿菌。標本來源以呼吸道為主，占61.11%。其次依次為血液、尿液和無菌體液。這種分布主要是由EICU感染疾病譜分布決定的，呼吸系統是EICU患者感染的常見部位。

非發酵菌鮑曼不動桿菌分離率位居首位，呼吸道標本是其主要來源，是EICU肺部感染的優勢條件致病菌。本研究中鮑曼不動桿菌耐藥形勢嚴峻，其對β內酰胺類、喹諾酮類、碳青霉烯類、氨基糖苷類藥物普遍耐藥，僅對替加環素、多黏菌素B敏感率較高，給臨床治療帶來了很大困難。這與鮑曼不動桿菌有多種耐藥機制，如產碳青霉烯酶、超廣譜β內酰胺酶、16S rRNA甲基化酶，外膜蛋白通透性降低，外排泵過度表達有關[2-3]。

腸桿菌科細菌肺炎克雷伯菌分離率僅次于鮑曼不動桿菌。值得注意的是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌占40%，遠高于同期全國平均水平[4-5]。2014年CRKP僅為13.33%，2015年和2016年出現爆發式增長，CRKP分別達到47.72%和50.00%。河南省部分地區是CRKP的高發地區，患者入住ICU、感染前使用碳青霉烯類抗生素、CRKP可通過質粒傳播等均是CRKP高發的原因[6-7]。本研究顯示，不同標本類型CRKP差異有統計學意義。呼吸道標本中CRKP最高(53.17%)，而血液標本中最低(5.88%)，尿液等其他標本中CRKP為27.50%。因此，臨床可根據感染部位選擇是否使用碳青霉烯類藥物。本地區CRKP以耐藥菌株克隆傳播為主。2017年CRKP數有所下降。臨床在治療肺炎克雷伯菌感染時謹慎選擇碳青霉烯類藥物可能是減少CRKP的重要措施之一。

本研究中，CRKP碳青霉烯酶耐藥基因以blaKPC為主，blaIMP及blaNDM少見。產KPC-2型碳青霉烯酶是河南地區肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制，這與大多數研究結果相符[8]。blaKPC基因通常位于質粒上，可以在不同種的細菌間傳遞，耐藥轉移速度快，所致感染病死率高。替加環素及多黏菌素是治療CRKP的有效藥物。而有研究表明，替加環素、多黏菌素耐藥的CRKP已經出現[9]。預防CRKP對其耐藥成為臨床感染治療及院內感染控制工作的重點之一。

與肺炎克雷伯菌不同的是，本研究中大腸埃希菌尚未出現碳青霉烯類藥物耐藥。其對阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均小于20%。血液標本是大腸埃希菌的首位來源，其次是痰液和尿液，這也與肺炎克雷伯菌主要來源于痰液不同。臨床在經驗性用藥時需考慮感染部位的病原菌分布。

總之，EICU革蘭陰性菌感染常見且耐藥形勢嚴峻，給臨床治療帶來了巨大的挑戰。根據質譜鑒定結果結合該細菌的藥敏流行病學及耐藥基因資料，經驗性用藥的精準度會更高。