肉種雞禽白血病與馬立克氏病混合感染的初步診斷

史榮華 周揚 李一民 張建軍 任丹 高巍

摘要? ? 2018年11月，江蘇省某肉種雞場26周齡雞群出現采食下降、精神沉郁、消瘦、產蛋下降、死亡等癥狀，臨床剖檢主要病變為肝臟、脾臟腫大，表面可見灰白色結節，腺胃、腎臟腫大，胸骨上可見圓形白色腫瘤病灶。為了明確肉種雞發病的原因及確定病原，無菌采取肝臟、腎臟等病變組織，開展了PCR鑒定和組織病理學觀察等實驗室診斷。結果表明，病料PCR檢測禽白血病毒和馬立克氏病毒為陽性，組織病理學觀察發現肝臟、脾臟、腺胃、心肌內彌漫大量MD和ALV-J特有腫瘤細胞。上述結果初步表明，該病例為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。

關鍵詞? ? 肉種雞;禽白血病;馬立克氏病;混合感染;診斷

中圖分類號? ? S858.31? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）09-0199-03

禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）感染引起的免疫抑制性疾病以及各種可傳播的良性和惡性腫瘤[1]。ALV屬于反轉錄病毒科C型反轉錄病毒屬，分為A～K 11個不同亞群，其中A、B、C、D、E、J、K 7個亞群可自然感染雞[2]，J亞群禽白血病病毒的致病力和感染性較強[3]，可引起肉雞、蛋雞、種雞髓細胞樣瘤細胞增生的一種腫瘤性疾病，在世界范圍內廣泛存在，目前臨床上多見骨髓細胞瘤或血管瘤與骨髓細胞瘤混合發生的病例[4]。雞馬立克氏病（MD）是由馬立克氏病病毒（MDV）引起的淋巴組織增生和淋巴腫瘤的一種疾病[5]。MDV屬于皰疹病毒科一種α皰疹病毒，這種病毒具有高度的傳染性，常以外周神經和其他各種組織器官的單核細胞浸潤形成腫瘤為特征。根據病毒株抗原性差異分為3個血清型，并且2～18周齡的雞均可感染發病，是危害養雞業的重要傳染病。禽白血病（AL）和馬立克氏病（MD）是家禽常見的2種病毒性腫瘤病，可水平傳播、垂直傳播，不僅使感染雞群的生產性能下降，而且容易引起免疫抑制，增加對其他疾病的易感性，給家禽養殖業造成巨大的經濟損失[6]。2018 年11月江蘇某肉種雞場發生疑似腫瘤病的雞群，經臨床剖檢及實驗室鑒定為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 病料信息

病料來源于江蘇省某肉種雞場，26周齡黃羽肉種雞，剖檢疑似腫瘤病癥狀，無菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等病料組織用于PCR鑒定以及組織病理學觀察。

1.2? ? 試驗材料

DNA提取純化試劑盒、2×Easy TaqSuperMix、普通瓊脂糖凝膠、DL2000 DNA Marker，根據參照文獻[7-8]設計了MDV、REV、ALV的鑒定引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見表1。

1.3? ? PCR檢測

采集病雞腫瘤病變組織，按1∶5加入含適當濃度抗生素的滅菌PBS緩沖液，充分研磨，反復凍融3次后，離心取上清[2]，用DNA提取試劑盒抽提組織液中的DNA，置-20 ℃備用。以提取的病毒DNA作為模板進行PCR擴增。反應體系為：DNA模板2 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL。反應程序為：95 ℃預變性 5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經l%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳處理后置于凝膠成像系統中拍照鑒定。

1.4? ? 病理組織學檢測

用福爾馬林固定病變組織（如肝臟、脾臟等），按文獻[9]制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，進行組織病理學診斷。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 病雞剖檢癥狀

現場剖檢發現，病死雞主要表現為肝臟腫大，表面彌漫性灰白色腫瘤結節，見圖1（a）（b）;脾臟腫大，有彌漫性灰白色腫瘤結節，見圖1（c）（d）;胸骨內外側有圓形白色腫瘤病灶，見圖1（e）（f）;腸道表面白色腫瘤結節，見圖1（g）;腎臟腫大，表面彌漫性白色腫瘤結節，見圖1（h）。

2.2? ? PCR鑒定

PCR產物經l%瓊脂糖凝膠電泳分析，結REV-LTR引物未擴增出目的條帶，MDV-meq擴增出目的條帶，大小約為1 058 bp，ALV-P27擴增出目的條帶，大小約348 bp（圖2）。該病料PCR檢測REV為陰性，MDV和ALV為陽性。

2.3? ? 組織病理學檢測

組織病理學顯示：肝內多個腫瘤病灶，肝內腫瘤細胞為MD特有的腫瘤細胞，見圖3（a）（b）;心肌內大量腫瘤細胞浸潤，心肌內腫瘤細胞為MD特有腫瘤細胞，見圖3（c）（d）;腺胃內大量腫瘤細胞浸潤 腺胃內腫瘤細胞為MD特有腫瘤細胞，見圖3（e）（f）;脾臟1內大量腫瘤細胞浸潤，脾臟1內腫瘤細胞為ALV-J特有腫瘤細胞，見圖3（g）（h）;脾臟2內大量腫瘤細胞浸潤，脾臟2內腫瘤細胞為MD特有腫瘤細胞，見圖3（j）（k）。

3? ? 討論

禽白血病和馬立克氏病是2種病原（分別屬于RNA病毒和DNA病毒）完全不同的疾病，并且都以類似的肉眼可見腫瘤病變為特征[10]。隨著規模化養殖的擴大，家禽疫病已經變得日益復雜，混合感染已經成為腫瘤病毒、免疫抑制性病毒感染的主要方式，給養殖業造成巨大損失[11]。造成ALV和MDV混合感染的主要原因可能有以下幾種：①ALV既可以垂直傳播，又可以水平傳播，祖代雞場白血病凈化不徹底，通過種雞垂直傳染給下一代，從而引起雛雞產生免疫抑制，免疫應答下降，即使雛雞接種MDV疫苗，仍會感染MDV野毒而發病;②除自然傳播方式外，接種了被外源性ALV污染的弱毒活疫苗，也會引起ALV的感染;③雛雞在免疫MDV疫苗時，免疫過程出現了問題，則會導致免疫效果降低或者免疫失敗，使雞群感染MDV野毒引起機體免疫抑制，最終通過水平傳播感染ALV[5];④養殖環境生物安全方面的缺失、飼養環境惡劣、粗放的飼養管理等也會促進病原的擴散與傳播[11]。

本試驗從江蘇省某肉種雞場采集病料，根據臨床解剖病變，PCR擴增及病理組織學分析，最終初步診斷該病例為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。J亞群禽白血病腫瘤的原發部位在骨髓，骨膜下可見白色石灰樣增生的腫瘤組織，隆起于骨表面[12]。對于此種混合感染的情況，目前主要實行凈化種群為主的綜合性防制措施[10]。注射疫苗是預防MD的有效方法，從CVI988/Rispens、814株單苗到cVI988/

Ripense+HVI二聯疫苗，每類疫苗能在一段時期內有效控制其發生[11];對于AL，目前還沒有有效的疫苗，更沒有有效的藥物可以治療。因此，比較好的辦法就是加強凈化淘汰，自行清除ALV—J陽性的雞群或者引進國外雞群時加強ALV—J篩查，最后逐步建立無ALV—J感染的雞群，改善飼養環境[13]。同時，還應加強種雞的飼養管理和嚴格的生物安全措施，以減少水平傳播，并選擇無外源病毒污染的疫苗進行合理免疫，避免因疫苗污染而導致雞群感染禽白血病[14]。本試驗診斷為該雞場下一步的預防和凈化工作起到一定的參考作用。

4? ? 參考文獻

[1] 李思菲，蘇紅芹，王一新，等.拉米夫定對禽白血病病毒的體內外抑制效應及其應用[J].中國預防獸醫學報，2016，38（9）：700-704.

[2] 林璐璐，王培坤，楊永立，等.40周齡三黃種雞暴發禽白血病的診斷與病原分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2017（8）：105-109.

[3] SIRONI G，MANAROLLA G，PISONI G，et a1.Myotropic avian leukosis virus subgroup J infection in a chicken[J].Journal of Veterinary Medicine，2010，53（7）：347-349.

[4] 顧玉芳，楊玉瑩，鐘蓓，等.蛋J亞群禽白血病與馬立克氏病混合感染的病理學診斷[J].湖北農業科學，2011，50（24）：5193-5195.

[5] 李海娟，石夢雅，谷戰明，等.ALV與MDV混合感染造成雞群臨床腫瘤暴發的診斷[J].中國家禽，2018，40（14）：58-61.

[6] 張洪海，劉青，邱波，等.地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J].畜牧獸醫學報，2009，40（8）：1215-1221.

[7] QI Gao，YUN Bingling，WANG Qi，et a1.Development and application of a multiplex PCR method for rapid differential detection of subgroup A，B， and J avian leukosis viruses[J].Journal of Clinical Microbiology，2014，52：37-44.

[8] ZHUANG Xinyu，ZOU Haitao，SHI Huoying，et al.Outbreak of Marek′s disease in a vaccinated broiler breeding flock during its peak egg-laying period in China s[J].Veterinary Research，2015，11：157.

[9] 馬樹興.禽傳染病實驗室診斷技術[M].北京：化學工業出版社，2005.

[10] 張登祥，猶雯，饒毅，等.血管瘤型禽白血病和馬立克氏病混合感染的診斷[J].中國畜牧獸醫，2010，37（8）：219-220.

[11] 楊永立，鐘興福，王培坤，等.2014年廣西地方雞群病毒性腫瘤病例的檢測分析[J].中國家禽，2015，37（17）：53-56.

[12] 竇新紅，沈海玉，竇套存.一例骨髓慵型禽白血病的診斷[J].中國家禽，2013，35（4）：53.

[13] 張志，趙宏坤，崔治中.J亞群禽白血病的診斷和防制[J].中國獸醫雜志，2004，40（3）：36-37.

[14] 常超越，閆艷娟，李蘊玉，等，蛋種雞禽白血病與大腸桿菌病混合感染的診治[J].獸醫臨床，2018（14）：130-132.

作者簡介? ?史榮華（1987-），男，江蘇泰州人，碩士，從事病毒免疫學研究工作。

收稿日期? ?2019-01-08