發酵對酸肉蛋白質結構的影響

常 榮，韋 誠，段珍珍，周才瓊*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

肉制品在加工保藏中普遍發生蛋白質的氧化降解，促進肽鍵的斷裂及疏水性氨基酸的暴露，導致蛋白質結構改變，增加風味物質結合位點，從而影響加工肉制品風味品質[1]。通常情況下，適度氧化水解有利于促進風味發展，而劇烈的降解會導致不良風味產生，嚴重的蛋白氧化聚集會使蛋白結構穩定性降低，導致產品品質下降[2]。

酸肉是一種以新鮮豬肉為原料，添加適量米粉發酵產酸后制成的一類流行于西南地區的地方特色美食。傳統酸肉一般在發酵約20 d開始食用，并采用發酵方式保藏直至食用完畢，周期約半年。有關酸肉的研究多集中在湖南侗族酸肉發酵條件[3]、微生物區系[4]及風味形成[5]等；本團隊在對渝黔地區酸肉發酵中微生物區系、風味品質等研究中，認為合適發酵時間在20～40 d[6-8]；考慮酸肉以發酵方式保藏，微生物及產酸等持續作用，使酸肉成為一個動態體系，其中的蛋白質會發生持續的氧化降解，這些變化可能影響酸肉蛋白質的結構，進而影響酸肉品質。因此，研究酸肉蛋白質在長時間發酵中的結構變化可提供酸肉發酵保藏中蛋白質營養和風味變化可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌、湖北大米、食鹽購自重慶北碚天生麗街永輝超市。大米炒至微黃，粉碎過20 目篩，備用。

尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氯化鉀、溴酚藍（bromophenol blue，BPB）、β-巰基乙醇（均為分析純） 重慶駿偉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 重慶市鈦新化工有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股有限公司；5810 R型臺式冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；DXR2拉曼光譜儀器美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 酸肉制備

豬肉洗凈瀝干，切成約3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，豬肉、米粉和食鹽按質量比85∶10∶5混勻，裝壇，水密封，20～25 ℃發酵。于不同發酵時間（0、20、50、80、110、140、180 d）取樣置－80 ℃貯藏，并在4 ℃解凍4 h后用于分析。

1.3.2 蛋白質的提取

1.3.2.1 肌漿蛋白的提取[9]

5 g絞碎樣品，加入20 mL冰冷50 mmol/L Tris-HCl提取液（pH 8.3，含10 mmol/L EDTA）高速勻漿1 min，勻漿液在4 ℃、2 000×g離心10 min后紗布過濾，取上清液，用雙縮脲法調整蛋白濃度后待分析。

1.3.2.2 肌原纖維蛋白的提取[10]

取5 g絞碎樣品，加入25 mL緩沖液A（pH 7.0、20 mmol/L PBS，150 mmol/L NaCl，25 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，4 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF），高速均質1 min（冰浴中進行），使用紗布過濾勻漿液除去結締組織等雜質，濾過液4 ℃、4 000×g冷凍離心15 min，棄上清液，沉淀部分先用0.1 mol/L的NaCl洗滌2 次后，再用25 mL PBS（20 mmol/L，pH 6.0）洗滌2 次。最后將沉淀懸浮于含有0.6 mol/L NaCl的PBS（20 mmol/L，pH 6.0）中，離心，上清液為肌原纖維蛋白，采用雙縮脲法測定蛋白含量。

1.3.3 蛋白質結構特性分析

1.3.3.1 肌漿蛋白表面疏水性測定

參考Cardamone等[11]的方法。以熒光強度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標作圖，曲線初始斜率為蛋白的表面疏水性。

1.3.3.2 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

參考Traore等[12]的方法。肌原纖維蛋白表面疏水性以其對BPB結合量表示，計算公式如下：

1.3.3.3 蛋白質分子間相互作用力測定[13]

溶液包括：0.6 mol/L KCl（S1）；20 mmol/L Tris，pH 8.0（S2）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mL SDS（S3）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mL SDS和8 mol/L尿素（S4）；20 mmol/L Tris，pH 8.0，包含1 g/100 mLSDS，8 mol/L尿素和2%（V/V）β-巰基乙醇（S5）；0.5 mol/L NaOH（S6）。取2 g絞碎肉樣（去除可見脂肪和筋膜），分別加入20 mL上述溶液，室溫下磁力攪拌4 h，其中S5攪拌前先100 ℃水浴2 min。樣品12 100×g離心30 min，吸取4 mL上清液至離心管中并加入1 mL 50%三氯乙酸溶液，3 ℃放置過夜，之后4 000×g離心20 min，沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液溶解，采用雙縮脲法測定溶解液蛋白含量。結果以各部分蛋白含量占S6蛋白含量的百分比表示。

1.3.3.4 內源熒光測定

參考Lobo等[14]的方法。激發波長283 nm或295 nm，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度1 500 nm/min，獲取300～400 nm波長之間的發射光譜。

1.3.3.5 紫外吸收測定

參考任麗娜[15]方法并適當修改。將樣品液用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至0.5 mg/L，以0.6 mol/L KCl溶液作為空白，波長掃描范圍為220～320 nm，測定樣品的紫外吸收及二階導圖譜，每個樣品重復3 次。

1.3.3.6 拉曼光譜測定

參考Zaj?c等[16]的方法。采用OMNIC軟件對圖譜進行基線校正、平滑等處理，Peakfit 4.12軟件進行分峰擬合。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析，Origin 8.6軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酸肉發酵中蛋白分子間相互作用力變化

表1 蛋白質分子相互作用力在酸肉發酵中的變化Table 1 Changes in protein-protein interactions during sour pork fermentation

本實驗采用5 種不同的溶劑規避不同的蛋白質相互作用力，其中KCl、SDS、尿素分別能夠規避靜電作用力、氫鍵、疏水作用力，而巰基乙醇則能夠打破二硫鍵，因此蛋白質在S1、S3、S4、S5中的溶解量分別表示靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵對蛋白三級結構的貢獻，結果見表1。發酵0 d時，S3＞S4＞S5＞S1＞S2，說明豬肉蛋白天然結構由氫鍵、疏水相互作用力、靜電相互作用力及二硫鍵共同維系；從量的角度看，主要是氫鍵和疏水相互作用。發酵后這幾種作用力對蛋白三維結構的貢獻發生了改變。隨發酵時間延長，蛋白質在S1和S2中的溶解度逐漸下降，180 d時，蛋白溶解度分別為發酵0 d時的24.96%和26.57%，可能是發酵產酸等誘發蛋白質天然結構改變，導致其發生變性聚集，進而引起蛋白鹽溶性下降。S3在發酵中逐漸增加，50 d后保持穩定略降，推測蛋白分子間氫鍵在發酵中不斷破壞又重新合成。S4和S5在發酵20 d快速增加后波動變化，均明顯高于0 d的溶解度，說明經發酵后蛋白疏水相互作用明顯增強，從而引起蛋白分子構象發生改變和蛋白聚集，此時，酸誘導蛋白的變性利于蛋白分子展開，使埋藏在分子內部的巰基外露被氧化成二硫鍵。另外，發酵20～80 d時S4＞S5＞S3，之后變為S5＞S4＞S3，表明二硫鍵在發酵80 d后的酸肉蛋白三維結構中起主導作用。S3～S5未呈規律性較強的變化，可能與發酵后形成非二硫共價鍵或參與了蛋白三維結構等有關[17]。這些改變對酸肉蛋白凝膠結構的形成和穩定性產生重要影響，可影響酸肉感官品質和營養特性。

2.2 酸肉發酵中蛋白表面疏水性的變化

隨發酵時間延長，肌漿蛋白表面疏水性略增后快速下降（峰值為發酵20 d），這可能與發酵初始時（20 d）肌漿蛋白分子逐漸舒展，構象變得疏松和不穩定，使埋藏于非極性環境的蛋白分子內部的疏水基團外露到極性環境中有關。隨發酵時間延長，疏水性氨基酸殘基大量外露，引起蛋白分子間疏水作用增強，蛋白質發生疏水聚集，使其表面疏水性下降。肌原纖維蛋白表面疏水性隨發酵進行快速下降后保持波動變化（圖1），說明酸肉的肌原纖維蛋白分子大部分疏水性氨基酸殘基主要被包埋在分子內部。谷值出現在發酵50 d時，這可能與發酵中pH值變化及蛋白質在酶作用下的降解有關[18]。

圖1 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白表面疏水性在發酵中的變化Fig. 1 Changes in surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins

2.3 酸肉發酵中蛋白紫外吸收的變化

圖2 酸肉蛋白質的紫外吸收及其二階導光譜圖的變化Fig. 2 Changes in zero-order and the second-derivative UV spectra of sour pork proteins

發酵20 d后肌原纖維蛋白的紫外吸收圖譜相對于發酵0 d差異明顯（圖2A1），說明發酵改變了酸肉蛋白的結構，特征峰出現波動變化主要與肌原纖維蛋白暴露的色氨酸等氨基酸殘基總量有關。經對紫外吸收光譜進行二階導運算，得肌原纖維蛋白紫外二階導圖譜（圖2A2），顯示發酵0 d時，284.5 nm和292 nm處有兩個負吸收峰，其中284.5 nm處吸收峰歸屬酪氨酸和色氨酸的共同作用；發酵20 d時紫外二階導光譜未發生紅移或藍移，發酵50 d后發生了小幅度紅移并保持穩定，說明芳香族氨基酸殘基向更加疏水的環境移動，平均疏水性增強。

不同發酵階段肌漿蛋白紫外吸收譜圖變化較大（圖2B1），說明肌漿蛋白三級結構變化較劇烈。發酵0 d時，肌漿蛋白紫外二階導圖譜（圖2B2）中285 nm和293 nm處有負吸收峰，發酵20 d后相對0 d時發生了約1～2.5 nm的藍移，表明酪氨酸和色氨酸的微環境極性增加。

2.4 酸肉發酵中蛋白內源熒光光譜變化

圖3 酸肉蛋白的內源熒光強度變化Fig. 3 Changes in intrinsic fluorescence intensity of sour pork proteins

如圖3A所示，發酵20 d時酸肉的色氨酸熒光損失顯著，隨發酵時間延長色氨酸熒光強度略增后逐漸減弱，180 d時的熒光強度約為發酵0 d時的65.7%，說明在發酵過程中酸肉蛋白暴露的色氨酸殘基逐漸減少；可能與蛋白變性舒展，暴露出更多疏水基團，蛋白質分子間相互作用力增強而發生疏水聚集，從而將更多色氨酸殘基包埋于蛋白分子內部疏水性更強的環境中有關。色氨酸熒光損失被認為是氧化改變肉類蛋白的初級表達和引起蛋白質營養價值損失[19]。另外，發酵0 d蛋白的最大發射波長為341 nm，發酵50 d紅移至345 nm，表明發酵中酸肉蛋白結構逐漸舒展，蛋白分子內部的色氨酸向極性更強的微環境暴露，這與通過UV測得的肌原纖維蛋白疏水性變化趨勢不一致，原因與UV所測結果為色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基的平均疏水性有關。有報道[20]指出當激發波長為290 nm以上時，可避免如酪氨酸等氨基酸殘基對色氨酸熒光的干擾。為此，考察激發波長295 nm時酸肉蛋白內源性熒光的變化（圖3B），在此激發波長下的色氨酸熒光強度變化趨勢與激發波長283 nm類似。但295 nm激發產生的熒光強度較弱一些。

2.5 酸肉發酵中蛋白拉曼光譜變化

本實驗采用拉曼光譜對酸肉進行原位檢測，并結合報道的蛋白質拉曼光譜[16]進行比對，對酸肉蛋白肽鍵骨架和氨基酸側鏈的拉曼譜帶進行指認，結果見圖4和表2。

圖4 酸肉蛋白質拉曼光譜圖（400～2 000 cm－1）Fig. 4 Raman spectra of sour pork proteins (400-2 000 cm-1)

表2 酸肉蛋白質的拉曼特征峰歸屬及指認Table 2 Assignment of some bands in the Raman spectra of sour pork proteins

2.5.1 S—S伸縮振動變化

圖5 酸肉蛋白質拉曼光譜圖（400～2 000 cm-1）Fig. 5 Raman spectra of sour pork proteins (400-2 000 cm-1)

二硫鍵是穩定蛋白質三級結構的作用力，其構象在拉曼光譜中的吸收譜帶為510～550 cm－1，其中515 cm－1附近特征峰為扭式-扭式-扭式構象，525 cm－1附近特征峰為扭式-扭式-反式構象，540 cm－1附近特征峰為反式-扭式-反式構象[21]。不同發酵時段酸肉均存在這三種構象（圖5）。隨發酵進行，各構象吸收峰均發生小幅波動變化，說明發酵在一定程度影響了蛋白質二硫鍵。發酵80 d后，525 cm－1附近的特征峰減弱甚至消失，而在529 cm－1或534 cm－1出現一個條帶更寬的特征峰，說明原本的二硫鍵發生損失或扭式-扭式-反式構象的二硫鍵可能向反式-扭式-反式構象轉變。

2.5.2 色氨酸殘基微環境變化

757 cm－1附近譜帶的伸縮振動可表征芳香族氨基酸中色氨酸殘基的微環境變化，當蛋白分子中色氨酸向極性溶劑暴露時，相對峰強度會減弱。發酵20 d時757 cm－1處歸一化強度由0 d的1.48下降至0.47并保持穩定（表3），說明經發酵后的酸肉蛋白大部分色氨酸殘基在疏水相互作用下暴露到極性更強的環境中，并在一定時間內保持相對穩定狀態；發酵110 d時峰強小幅回升，隨后逐漸減弱，該變化趨勢與蛋白熒光光譜檢測趨勢相似。

2.5.3 酪氨酸殘基微環境變化

特征峰處于850 cm－1和830 cm－1處或鄰近譜帶可監測色氨酸殘基周圍的微環境及判斷色氨酸殘基被包埋程度[22]。由表3可知，發酵0 d時850 cm－1/830 cm－1峰強比為0.95，說明原料蛋白色氨酸殘基主要為被包埋狀態，有較強的氫鍵結合[23]。隨發酵時間延長逐漸增加后在1.08～1.55間波動，表明色氨酸殘基暴露于水溶液或極性環境中，或作為中到弱度氫鍵的接受體和供體。與Liu Ru等[21]報道魚和豬肉在加工鹽腌階段，850 cm－1/830 cm－1峰強比呈增加趨勢吻合。有報道單獨酸化的肌原纖維蛋白色氨酸殘基趨向于埋藏在肌球蛋白分子內部，而添加內源蛋白酶后色氨酸殘基重新暴露到蛋白分子表面，并認為發酵中蛋白質先發生變性聚集，后發生內源性蛋白酶水解[24]。酸肉在發酵中可能也發生了類似變化。

2.5.4 CH3和CH2彎曲振動

1 450 cm－1附近的拉曼譜帶由CH3和CH2的彎曲振動引起，可表征脂肪族氨基酸微環境變化，對疏水相互作用敏感[25]。由表3可知，1 450 cm－1峰強逐漸下降并波動變化，表明不同發酵時段脂肪族氨基酸疏水環境狀態存在一定差異。

2.5.5 C—C鍵伸縮振動

890～1 060 cm－1拉曼譜帶可表征C—C鍵伸縮振動變化，也可獲取蛋白質二級結構α螺旋信息。如表3所示，940 cm－1處的歸一化峰強度總體呈逐漸下降趨勢，表明α-螺旋結構含量降低，但發酵110 d時峰強度相對其他發酵時段有所增強，可能是蛋白質進一步降解引起多肽骨架變化導致。940 cm－1處峰強度變化與曲線擬合計算α-螺旋含量變化趨勢基本一致，也印證了發酵110 d時蛋白質可能發生了重組，與曹錦軒等[26]報道吻合。

2.5.6 脂肪族C—H的振動

2 800～3 000 cm－1拉曼光譜可反映脂肪族C—H的伸縮振動變化。如圖6所示，發酵0 d酸肉在2 854 cm－1和2 931 cm－1處有兩個明顯強峰，前者由酰基和CH2對稱性伸縮振動引起，后者由CH2和CH3不對稱性伸縮振動引起。發酵20 d后這兩個峰均向高波數偏移，分別移至2 880 cm－1和2 935 cm－1附近譜帶，這可能與脂肪族氨基酸的暴露程度有關[27]。另外，2 935 cm－1處的歸一化峰明顯強于2 880 cm－1處，說明酸肉脂肪族氨基酸主要以CH2不對稱性振動為主。總體上，2 935 cm－1處峰強逐漸減弱后逐漸增強，但各發酵時段峰強均低于發酵0 d時，這可能與發酵后蛋白疏水性增強有關[28]。

2.5.7 二級結構變化

蛋白質酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）常用于研究蛋白質二級結構[29]。肉類蛋白用于表征蛋白二級結構酰胺I帶的拉曼圖譜通常集中在1 645～1 685 cm－1，包括α-螺旋、無規卷曲、β-折疊和β-轉角，歸屬的拉曼譜帶分別為1 650～1 658 cm－1、1 660～1 665 cm－1、1 665～1 680 cm－1和1 680 cm－1[30]。采用Peakfit 4.12軟件對酸肉蛋白酰胺I帶進行傅里葉去卷積結合曲線擬合以獲取蛋白二級結構信息變化，得酸肉蛋白在不同發酵時段酰胺I帶去卷積后的圖譜（圖7）。發酵0 d時主導峰位于1 655 cm－1處；20 d時1 654 cm－1主導峰的優勢明顯減弱；50 d時主導峰偏移至1 662 cm－1，說明α-螺旋逐漸展開；80 d時出現雙主導峰（1 655 cm－1和1 662 cm－1），110 d后主導峰又重回1 655 cm－1，說明發酵80～110 d時段α-螺旋有可能重新生成；繼續發酵，主導峰逐漸向高波長處移動，180 d時，1 663 cm－1和1 669 cm－1成了新的主導峰，說明無規卷曲結構或β-折疊有所增加。

圖7 發酵過程中酸肉蛋白質酰胺I帶去卷積變化圖譜Fig. 7 Deconvolved and curve fitted bands of amide I of sour pork proteins during fermentation

表4 發酵過程中酸肉蛋白二級結構相對含量的變化Table 4 Changes in the relative amounts of protein secondary structures in sour pork during fermentation

由表4可知，發酵0 d蛋白α-螺旋相對含量最高，無規卷曲最低。隨發酵進行，α-螺旋和β-轉角相對含量逐漸下降；β-折疊呈上升趨勢，發酵140 d時超過α-螺旋成為二級結構中主體元素；無規卷曲變化趨勢與α-螺旋變化基本相反。這可能是發酵使α-螺旋解旋生成β-折疊或無規卷曲以及β-轉角和β-折疊相互轉化，使α-螺旋、β-轉角相對含量逐漸下降，β-折疊和無規卷曲相對含量上升。有報道[31]指出pH值從7.0降至5.0時，α-螺旋減少、β-折疊增多；NaCl添加量增加，豬肉糜蛋白α-螺旋、β-轉角降低，而β-折疊和無規卷曲上升[32]，這與本研究變化趨勢相似。表明酸肉發酵中添加的食鹽及發酵產酸均導致了蛋白質二級結構的變化。其中，發酵80～110 d時α-螺旋相對含量略有上升，可能在此時發生了結構重組，曲線擬合結果與去卷積結果基本吻合。引發重組的原因可能與蛋白降解或蛋白經一定程度酶解引起蛋白質結構、蛋白等電點和疏水性改變有關[33]。

3 結 論

酸肉發酵中優勢微生物為乳酸菌，優勢菌群主要是片球菌屬（Pediococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）[6]。有報道指出乳酸菌可分泌胞外蛋白酶[34]，加上乳酸菌產酸及發酵中添加鹽的脅迫作用，酸肉蛋白質在長時間發酵中發生了一系列變化，進而影響酸肉的品質。

對酸肉蛋白進行相關三級結構分析發現，酸肉肌原纖維蛋白表面疏水性快速下降后呈較小幅度的下降趨勢，且其色氨酸殘基發生了熒光損失現象，說明經發酵后肌原纖維蛋白可能發生了疏水聚集。蛋白二級測定結果顯示，α-螺旋、β-轉角含量基本呈現下降趨勢，β-折疊和無規卷曲的含量則基本上呈上升趨勢，其中發酵110 d時酸肉蛋白二級結構可能發生了重排現象。蛋白分子間相互作用力結果顯示，蛋白分子間相互作用力在發酵中變化顯著，靜電相互作用力逐漸減弱，而疏水作用力和二硫鍵明顯增強并呈波動變化，是維持酸肉蛋白穩定性的主要作用力。這些結果表明，發酵后，可能在酸和鹽的誘導蛋白變性作用下，酸肉蛋白疏水相互作用力顯著增強，導致蛋白發生疏水聚集，將更多的疏水性包埋于蛋白分子內部，引起表明疏水性下降和蛋白熒光強度發生下降，而疏水作用力增強和二硫鍵的增加引起的蛋白聚集和交聯，以及氫鍵作用力增強可能是引起α-螺旋相對含量減少，β-折疊相對含量增多的主要原因。

綜上，采用發酵的方式保藏酸肉，會導致蛋白質二級結構、三級結構發生一系列變化，這些變化可從蛋白質結構水平解釋發酵對酸肉品質的影響。