微粒皮移植聯合醫用自凝集水凝膠修復家兔全層皮膚缺損的實驗研究

陳斌，王曉輝，李睿智，史夢柔，李東風，于歡，劉偉偉，崔曉雪，劉山海，高萍

（1.天津市醫藥科學研究所，天津 300020；2.愛美客技術發展股份有限公司，北京 100022）

本研究將有一定黏合能力和組織修復活性的自凝集水凝膠（醫用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠）聯合微粒皮移植，評估其修復動物大面積全層皮膚創傷的效果。實驗中使用以羧甲基葡萄糖胺為主要前體的產品，其凝膠原液和雙重交聯劑液體混合后，在物理和化學催化下，可溫和、迅速地變為有黏附性的彈性凝膠，且有一定強度，對微粒皮起到保護和固定作用。自凝集水凝膠使用方便，與微粒皮移植手術聯用利于皮膚創面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗動物

醫用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠（北京愛美客技術發展股份有限公司），凝膠原液和聚合劑分別裝載在雙聯裝置的2個針筒內（批號20141008，北京愛美客技術發展股份有限公司），麻醉用戊巴比妥鈉（批號127K1005，北京化學試劑公司），生理鹽水（批號4D74G1，天津大冢制藥有限公司），芝麻油（批號A0318542，比利時ACROS公司），家兔（北京隆安實驗動物養殖中心）。

1.2 方法

1.2.1 皮內刺激實驗①浸提液制備：將實驗樣品推棄掉初始端0.5 ml后取余下混合樣品，30 min凝膠凝固后，以0.2∶1.0比例制備浸提液，浸提介質分別為生理鹽水和芝麻油。②皮內刺激：家兔2只，背部去毛備皮，75%乙醇消毒皮膚，于脊柱兩側各選擇10個注射點，每點間隔2 cm，每點皮內注射0.2 ml實驗液。左側前后5點分別注射實驗樣品生理鹽水浸提液和溶劑對照生理鹽水；右側前后5點分別注射實驗樣品芝麻油浸提液和溶劑對照芝麻油。注射后24、48及72 h觀察注射局部及周圍皮膚組織反應。

1.2.2 自凝集水凝膠聯合微粒皮移植①用物理凍融法制備脫細胞真皮：家兔背部皮下取薄中厚斷層皮片，-70℃條件下反復凍融，用十二烷基硫酸鈉溶液反復超聲清洗，得到脫細胞真皮。病理切片觀察脫細胞效果。②自凝集水凝膠聯合微粒皮移植：將實驗組5只家兔麻醉，背部切除全層皮膚，形成3.5 cm×3.5 cm 缺損創面，并取刃厚皮切碎成1 mm×1 mm微粒皮，直接用自體微粒皮擺放創面，液態黏合凝膠原液滴灑，待凝膠自凝（約1、2 min）即實現微粒皮固定，創口封閉；再用準備好的自制脫細胞真皮緊密覆蓋創面，將真皮四角與周圍皮膚縫合固定，包扎傷口。同時設3個對照組，分別為不植入微粒皮組、不使用凝膠組及凡士林紗布覆蓋物組（將脫細胞真皮改為凡士林紗布），其余步驟與實驗組相同，各組5只家兔。觀察期為4周，觀察傷口愈合情況。③病理觀察：切取愈合創面皮膚，立即浸入10%中性甲醛固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟及包埋后切片，用蘇木精-伊紅染色法（HE）行常規病理檢查。

2 結果

2.1 皮內刺激實驗結果

自凝集水凝膠的生理鹽水和芝麻油浸提液的局部組織反應綜合平均計分與溶劑對照平均計分之差均為0.0，符合標準中平均計分之差＜1.0的要求，產品無刺激性。

2.2 家兔異體脫細胞真皮的脫細胞效果

鏡下纖維組織中未見殘存細胞，脫細胞效果良好。見圖1。

圖1 脫細胞真皮 （×40）

2.3 自凝集水凝膠聯合微粒皮移植的傷口愈合情況

實驗組4周后脫細胞真皮脫落，傷口均完全愈合并生出毛發。愈合創面HE染色常規病理切片下可見表皮層與真皮層修復較好，有少量炎癥細胞。不植入微粒皮組在4周創口處仍有約2 cm×2 cm區域結痂。病理可見結痂區域周圍有大量膿細胞和炎癥細胞。不使用凝膠組4周傷口愈合，有2只有局部較小結痂或增生，病理切片顯示多數缺損的表皮層與真皮層修復較好，小結痂或增生處表皮層已修復，但真皮和皮下有較多炎癥細胞浸潤。凡士林紗布覆蓋物組家兔4周后創面均完全愈合，病理結果與實驗組相近。見圖2、3。

圖2 各組術后4周創面愈合情況

圖3 各組術后4周創面病理切片圖

3 討論

目前，臨床用人工皮治療大面積皮膚缺損局限很多，如種子細胞通常來源于新生兒包皮組織。使用異體細胞會引起排異反應，如選用自體皮膚細胞，需要體外培養一定時間，不適用于緊急手術[1]，且結構和力學強度等無法與自體皮膚組織相比[2]。除仍在實驗階段的干細胞人工皮外，都不具備皮膚附屬器官[3]。自體微粒皮移植是另一種修復大面積嚴重皮膚損傷的臨床治療方式，實驗中家兔在自體微粒皮移植術后，新生皮膚的結構較好，鏡下可見附屬器官，還可見新生毛發。

自體微粒皮移植，指將面積＜1 mm2自體皮片[4]植于皮膚創面上，并在接種面上敷以保護層（如異體皮、脫細胞皮膚及人工真皮或高分子敷料甚至普通敷料[5-9]）的皮膚移植術，用于治療大面積深度燒傷或皮膚剝脫的治療。術中所用自體皮與創面面積比約為1：10～1∶20[10]，可緩解短時間內自體皮源有限而創面面積較大的矛盾[11]。

實驗中不使用凝膠組部分創面在愈合后有局部小結痂和增生，推斷與微粒皮植入后的異位翻轉有關。邱宇軒等[12]使用小型豬皮膚缺損模型，未解決微粒皮定位問題。自凝集水凝膠能進行原位交聯，在傷口處迅速形成凝膠，很好地解決微粒皮定位問題，有效提高微粒皮的成活率。張旭輝等[13]用脫細胞真皮微粒與微粒皮混合種植證明，合適的基質支持對微粒皮的生長修復有利。本實驗采用新上市的醫用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠與微粒皮移植手術聯合，創口處快速成形凝膠，保護傷口，為移植組織的生長提供結構支持。相比黏附力較差的透明質酸類等凝膠[14]，本實驗采用的產品還有一定的黏附性能。4周的實驗觀察中，實驗組家兔皮膚愈合良好，未出現微粒皮翻轉導致的局部小結痂等病變。而覆蓋物脫細胞真皮改為用凡士林紗布后，發現創面修復效果尚可，提示將自凝集水凝膠聯合微粒皮移植可降低對覆蓋物的要求，節約手術成本。

在手術中局部填充自凝集水凝膠抑制組織黏連，能起到很好的抗黏連效果[15]。本研究也證實，該材料生物相容性好，無皮膚刺激性。手術觀察發現自凝集水凝膠的黏合強度還有待提高，未來的研究可進一步優化配方，提高其機械性能和黏合強度。遠期可使自凝集水凝膠結構中連入附著功能性分子，通過其與細胞膜的化學連接[16-17]，加強微粒皮細胞與創口面的結合作用；另外，凝膠中引入一些活性分子，并用某些方法使其定向分布，可誘導和促進皮膚組織生長和血管形成，這些都是未來的研究方向。