神經病理性疼痛大鼠不同大小DRG神經元興奮性分型的研究*

譚朝陽，周穎，屈祖衛，張萌，陳沁怡，田俊杰，許珍珍，鄧詩瑜，李麗，馬克濤，司軍強

[1.石河子大學醫學院 生理教研室（新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室），新疆 石河子 832000；2.石河子大學藥學院 藥理系，新疆 石河子 832002]

神經病理性疼痛是一種慢性疼痛，持續6 個月以上，它通常是由炎癥、燒傷、軀體感覺系統的疾病或功能紊亂等造成的。根據2011年的流行病學調查顯示，神經病理性疼痛的患病率為3.3%～8.2%[1]。目前，坐骨神經分支選擇性損傷（spared nerve injury,SNI）模型已經被廣泛用于神經病理性疼痛的研究[2-4]，該模型能較穩定地改變實驗動物的行為學，且能造成與臨床神經病理性疼痛相似的綜合癥狀。背根神經節（dorsal root ganglion,DRG）神經元作為外周感覺傳入的第一級神經元，在痛覺的產生和傳遞中發揮重要作用。研究表明，DRG 神經元大小不一，其直徑的大小與其功能間存在關系。其中，小直徑的DRG 神經元由無髓鞘的C 纖維（C）和薄髓鞘的A 纖維（Aδ）組成，傳遞傷害性刺激、熱刺激和機械刺激產生的感覺信號，而大直徑的DRG 神經元由有髓鞘的A 纖維（Aβ）組成，傳遞非傷害性的刺激。不同大小神經細胞間的功能差異，可能是由神經元的化學物質、解剖、電生理特性及神經元對疼痛信息處理模式的差異共同造成的[5-6]。興奮性是衡量神經細胞功能的最基本指標，人們通常用動作電位發放頻率的高低來評價細胞的興奮性，發放頻率越高，興奮性也就越高，反之亦然。有研究者根據發放頻率和注入電流強度之間的關系將DRG 分為3 種興奮類型[7]。基于此，本實驗研究神經病理性疼痛狀態下DRG 神經元興奮性分型的變化，并在此基礎上分析興奮性分型與細胞大小的關系，希望能從興奮性分型和細胞大小的角度對神經病理性疼痛的產生機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD 大鼠75 只，體重180～220 g，雌雄不拘，由新疆醫科大學動物實驗中心提供（動物編號：SCXK 新2003-0001）。將大鼠隨機分成Control 組、Sham 組和SNI 組。其中，Control 組5 只（行為學實驗5 只），Sham 組35 只（行為學實驗5 只，膜片鉗實驗30 只），SNI 組35 只（行為學實驗5 只，膜片鉗實驗30 只）。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶Type Ⅲ、膠原酶Type IA、胰蛋白酶抑制劑、DMEM 培養基（購自美國Sigma 公司），Multi Clamp 700B 膜片鉗放大器（美國Axon 公司），P-2000 微電極拉制儀（美國Sutter 公司），Digidata 1550A 數據采集系統（美國Axon 公司），MP-225 微操縱儀（美國Sutter 公司），UGO BASILE 37370 全自動熱輻射刺激儀（意大利Gemonio 公司）。

1.3 動物模型復制

參照DECOSTERD 和RICHNER 等[2，8]的方法，測量并記錄各組大鼠的體重，用3%戊巴比妥鈉（3 g 戊巴 比妥鈉粉劑溶入100 ml 生理鹽水）按照0.17 ml/100 g的劑量麻醉各組大鼠。取俯臥位固定于鼠板上，切口處附近用剃毛刀剃毛暴露皮膚，碘伏消毒鋪巾。于左后腿外側近髂后上棘處平行于股骨劃開皮膚，順肌肉紋理鈍性分離股二頭肌，用玻璃分針暴露并分離坐骨神經的3 個分支（脛神經、腓總神經、腓腸神經）。用3-0 醫用真絲編織線分別結扎脛神經和腓總神經，系緊后在結扎遠端切斷，保留2～4 mm 的遠側殘端，分層縫合肌肉和皮膚。動物單籠分開飼養用于實驗。Sham 組大鼠麻醉及暴露神經的方法同上，用玻璃分針分離3 個分支后，不做任何處理，隨即分層縫合肌肉和皮膚，單籠飼養。

1.4 記錄熱縮足潛伏期

參照本實驗室前期研究[9-10]，在模型復制前1 天、模型復制后第1、7、14 和21 天對Control 組、Sham組及SNI 組大鼠進行熱縮足潛伏期的測試。設定UGO BASILE 37370 全自動熱輻射刺激儀參數：紅外線強度IR 值為50，時間上限為30 s。將大鼠放置于玻璃面板上的有機玻璃觀察盒內，移動玻璃板下的紅外線發射器。瞄準大鼠后肢足心部位照射，按動計時開關。大鼠受照射后肢抬離面板，儀器感應并停止記時，此時記錄到的時間為大鼠的熱縮足潛伏期，將其作為疼痛閾值的指標。間隔30 min 待大鼠安靜后，進行下一次測量。每只大鼠測量3 次，取平均值。

1.5 記錄冷刺激抬足時間

在熱縮足潛伏期測試結束30 min后，待大鼠安靜，進行冷刺激抬足時間的測試。參照2014年NORCINI等[11]的方法，將大鼠放置在自制的觀察籠內，待其安靜，小心地將0.1 ml 丙酮滴到大鼠左后足底外側的皮膚上，立即用計時器計時。大鼠出現抬足的現象，直至大鼠將左后足放下時，停止計時。此時記錄到的時間就是大鼠的冷刺激抬足時間。間隔30 min 待大鼠安靜后，進行下一次測量。測量3 次，取平均值。所有測量都在當日18：00～20：00 進行。

1.6 急性分離消化DRG 神經元

在本實驗室前期研究[12-13]的基礎上略做改進，用頸椎脫臼法處死大鼠，粗剪剪開其背部皮膚，沿脊柱兩側取出L4～L6 段脊柱。將取出的脊柱沿矢狀面對半剖開，放入盛有氧飽和的細胞外液中（細胞外液成分：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 10 mmol/L，Sucrose 20 mmol/L，CaCl23.32 mmol/L，用1 mol/L 的NaOH 調節pH 值為7.35～7.45，蔗糖調節溶液的滲透壓為772.5～849.75 kPa）。在10 倍顯微鏡下，于剖開的左側椎管內側去除脊髓，用游絲鑷剝除結締組織被膜，逐個取出椎間孔中的DRG 及其相連的神經根。用精細角膜剪和游絲鑷仔細剪除與DRG 相連的神經根。將取出的DRG 放入直徑為4 cm 的玻璃皿中，用精細角膜剪將DRG 充分剪碎，用膠頭滴管將剪碎的組織轉移入15 ml 的離心管中，隨后加入3 ml 配制好的消化酶溶液（胰蛋白酶Type Ⅲ0.24 mg/ml 和膠原酶Type IA 0.6 mg/ml，溶劑為DMEM 培養基）。將EP 管放入37℃水浴鍋中，消化2～4 min，邊消化邊吹打，避免產生氣泡。消化結束后立即加入少量胰蛋白酶抑制劑終止消化。用膠頭滴管將細胞懸液滴到膜片鉗專用的細胞培養皿中，靜置待細胞貼壁，待細胞貼壁充分后，加入氧飽和的細胞外液。

1.7 全細胞膜片鉗記錄

參照本實驗室原有方法[12-14]，將盛有急分離DRG神經元的細胞培養皿放置在膜片鉗顯微鏡載物臺上，100 倍顯微鏡下選取膜表面光滑、整體透亮、狀態良好的DRG 細胞作為實驗對象。選用Sutter Instrument 公司帶芯的硼硅酸鹽玻璃毛坯，使用P-2000 微電極拉制儀拉制成微電極，實驗選取電阻值為2～8 MΩ 的微電極，充灌電極內液（K-Gluconate 130 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，MgCl2·6 H2O 1.2 mmol/L，CaCl22 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-Glucose 7.5 mmol/L。用1 mol/L 的KOH 調節pH 值為7.35～7.45，蔗糖調節溶液的滲透壓為772.5～849.75 kPa），將充灌好細胞內液的玻璃微電極連接在微操縱儀上，用5 ml 空注射器給予一定正壓。操作微操縱儀，使微電極尖端靠近并接觸細胞，接觸細胞的瞬間可以從膜測試窗口觀察到電極電阻略微升高。隨后撤去正壓，用嘴吸法給予微電極內部一定負壓，同時將鉗制電位逐步調節至-60 mV，待細胞與電極間形成GΩ 封接后，用嘴吸破膜法或同時輔助以電擊破膜法破膜（膜片鉗放大器提供的Zap 功能）。破膜后，阻值仍維持在GΩ 以上的細胞用于實驗。

在顯微鏡下記錄細胞直徑。在I=0 模式下記錄細胞的靜息電位，在電壓鉗模式下（鉗制電位-60 mV），記錄膜電容。在電流鉗模式下，給予細胞一系列斜坡刺激記錄動作電位。記錄的信號經Multi Clamp 700B膜片鉗放大器放大，給予10 kHz 的濾波后，由Axon Digidata 1550A 數模/模數轉換器轉換，采樣頻率為10～20 kHz。

1.8 統計學方法

熱輻射刺激縮足潛伏期測量值和冷刺激抬足時間的結果采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，全細胞膜片鉗數據應用Clampex 10.6 軟件采集記錄，用Clampfit 10.6 軟件進行測量分析，用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，所有數據最終運用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖。計量資料以均數±標準差（±s）表示，不同時間點的比較采用重復測量設計的方差分析，其余計量資料3 組及以上的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學測試結果

Control 組、Sham 組及SNI 組術前1 天、術后第1、7、14 和21 天的熱縮足潛伏期的比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點熱縮足潛伏期有差異（F=427.215，P=0.000）；②3 組間熱縮足潛伏期有差異（F=99.294，P=0.000）；③3 組間熱縮足潛伏期隨時間的變化趨勢無差異（F=0.007，P=0.993）。見表1 和圖1。

Control 組、Sham 組及SNI 組術前1 天、術后第1、7、14 和21 天的冷刺激抬足時間的比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點冷刺激抬足時間有差異（F=33.984，P=0.000）；②3 組間冷刺激抬足時間有差異（F=2.940，P=0.024）；③3 組間冷刺激抬足時間隨時間的變化趨勢有差異（F=78.158，P=0.000）。說明3 組的不同處理方式對冷刺激抬足時間的影響有差異。見表2 和圖2。

表1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化 （s，±s）

表1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化 （s，±s）

組別 n術前1 天 術后第1 天 術后第7 天 術后第14 天 術后第21 天Control 組 5 25.3±3.3 24.3±3.4 25.3±3.6 24.7±3.9 25.8±3.4 Sham 組 35 26.1±3.5 25.2±3.6 25.6±4.1 24.1±3.9 25.4±3.4 SNI 組 35 25.9±3.6 23.3±3.8 26.4±3.1 24.2±3.2 25.3±3.7

圖1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化

2.2 SNI 大鼠DRG 神經元的興奮性分型發生改變

為明確正常大鼠DRG 神經元的興奮性分型情況，運用全細胞膜片鉗技術，在電流鉗模式下給予記錄電極內一個斜坡刺激（時長1 000 ms，電流強度0～2 500 pA），再根據細胞對注入刺激的不同反應將細胞分為3 種類型。1 型細胞：在給予較小強度（50～500 pA）刺激時就能產生較低頻率的動作電位，并且隨著電流強度增加動作電位頻率逐漸增加。2 型細胞：在給予較小強度的刺激時，不產生動作電位；但在給予較高電流強度（1 500～2 500 pA）刺激時，出現較高頻率的動作電位。3 型細胞：興奮性較低，不產生動作電位（見圖3）。結果表明，正常大鼠DRG神經元存在3 種興奮性類型的細胞，進一步對3 種類型細胞的主被動模特性進行分析（見表3）。方差分析結果顯示：1、2 和3 型細胞的靜息電位比較差異無統計學意義（P＞0.05）。1、2 和3 型細胞直徑比較差異有統計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，1 型 細胞直徑小于3 型細胞直徑（P＜0.05），2 型細胞的直徑與其他兩種類型細胞比較差異無統計學意義（P＞0.05）。1、2 和3 型細胞膜電容比較差異有統計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，1 型細胞的膜電容低于3 型細胞的膜電容（P＜0.05）。

表2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化 （s，±s）

表2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化 （s，±s）

組別 n術前1 天 術后第1 天 術后第7 天 術后第14 天 術后第21 天Control 組 5 2.62±0.82 2.44±0.76 2.83±0.86 2.53±0.88 2.71±0.77 Sham 組 35 2.59±1.30 3.21±1.34 2.82±1.21 2.42±1.32 2.79±1.37 SNI 組 35 2.61±1.46 6.52±1.33 8.79±1.27 11.62±1.45 12.81±1.22

圖2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化

為明確SNI 復制模型前后，大鼠DRG 神經元興奮性分型如何變化，本研究運用全細胞膜片鉗技術，在電流鉗模式下對463 個DRG 細胞（Sham 組205 個，SNI 組258 個）進行記錄。根據興奮性的3 種類型進一步分類，可以看出：Sham 組中，1、2 和3 型細胞的構成比分別為44.39%、4.88%和50.73%；而SNI 組中，相應的數據為54.26%、7.36%和38.37%。兩組間各型細胞的構成比有差異（P＜0.05），SNI 組的細胞構成比與Sham 組比較，差異有統計學意義（χ2=7.340，P=0.025），1 和2 型細胞構成比增加，而3 型細胞的構成比降低。見圖4。

圖3 SD 大鼠DRG 神經元興奮性分型

表3 SD 大鼠不同興奮性類型DRG 的基本特性 （±s）

表3 SD 大鼠不同興奮性類型DRG 的基本特性 （±s）

注：?與3 型比較，P＜0.05

分型 直徑/μm 靜息電位 /mV 膜電容/pF 1 型 27.34±4.99?-50.87±7.10 32.54±13.44?2 型 30.25±5.83-53.13±10.04 35.87±18.44 3 型 30.40±8.97-50.88±11.35 40.21±22.94 F 值 4.388 0.447 3.803 P 值 0.014 0.640 0.024

2.3 SNI 模型復制前后不同大小DRG 神經元興奮性分型的變化

為探討正常SD 大鼠DRG 神經元興奮性分型與直徑之間的關系，本研究比較Control 組內不同大小神經元各興奮性分型細胞的構成比。細胞按直徑大小分為：小細胞（直徑＜25 μm）、中細胞（25 μm ≤直徑＜40 μm）和大細胞（直徑≥40 μm），再按照興奮性分型進一步分類。其中，小細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為44.44%、2.22%和53.33%；中細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為50.00%、5.88%和44.12%；大細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為12.50%、4.17%和83.33%。可以看出，中、小細胞3 型細胞的構成比與大細胞比較，差異有統計學意義（χ2=7.210，P=0.027），中、小細胞3 型細胞的構成比較低，而1型和2 型細胞的構成比較高。見圖5。

為探討神經病理性疼痛狀態下，DRG 神經元興奮性分型和直徑之間的關系，比較SNI 組內不同大小神經元各興奮性分型細胞的構成比。按直徑大小以及興奮性分型進行分類，其中，小細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為43.10%、3.45%和53.45%；中細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為59.04%、9.04%、31.91%；大細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為33.33%、0.00%和66.67%。可以看出模型復制后，中細胞1、2 和3 型細胞構成比與大細胞比較，差異有統計學意義（χ2=6.390，P=0.041），中細胞3 型細胞構成比較低，而1 和2 型細胞構成比較高。小細胞1、2 和3 型細胞構成比與大細胞比較，差異無統計學意義（χ2=0.960，P=0.620）。見圖6。

圖4 SNI 模型大鼠DRG 神經元興奮性分型的變化 （±s）

圖5 SD 大鼠DRG 神經元興奮性分型與直徑的關系 （±s）

圖6 SNI 模型大鼠DRG 神經元興奮性分型與直徑的關系 （±s）

3 討論

神經病理性疼痛是指由軀體感覺神經系統的損傷或疾病而直接造成的疼痛[15]，包括皰疹后神經痛、三叉神經痛和中風后疼痛等。研究發現，神經病理性疼痛與DRG 神經元的興奮性密切相關。HODGKIN[16]在放電頻率與注入電流強度間的關系的基礎上，提出關于神經元興奮性分型的理論。XIE 等[7]研究發現，DRG 神經元也能表現出基于動作電位爆發模式的不同興奮性分型，且發現神經元興奮性分型的比率不是一成不變的。在DRG 慢性壓迫模型導致的慢性疼痛狀態下，1 型神經元的比率顯著增加，而興奮性較低的3 型神經元的比率顯著減少。該改變表明一部分3型神經元在病理狀態下轉化成興奮性較高的1 型神經元。本研究結果顯示，正常SD 大鼠DRG 神經元存在3 種興奮性類型，興奮性高的1 型細胞其直徑和膜電容明顯小于興奮性低的3 型細胞；坐骨神經選擇性損傷后，大鼠DRG 神經元的興奮型類型發生了改變，1 型和2 型細胞比例增大，3 型細胞比例減少，表明神經病理性疼痛狀態下，興奮性低的3 型細胞向興奮性高的1 型和2 型細胞轉化。

研究報道，不同大小的DRG 神經元，其功能也存在不同。這種功能上的差異，可能是由神經元的化學物質、解剖、電生理特性和神經元對疼痛信息處理模式的差異共同造成的[5-6]。例如，按照與IB4 結合的不同特點，小直徑的DRG 被分為IB4 陽性的肽能神經元和IB4 陰性的非肽能神經元，而大直徑DRG的NF200 表達為陽性[17-18]。有研究者還通過多種單細胞技術，將DRG 神經元分為10 種類型和14 種亞型[19]。研究表明，在DRG 慢性壓迫模型引起的NP 狀態下，大直徑的DRG 的興奮性分型發生明顯的變化，并且該變化與DRG 中超極化激活的陽離子電流的大小變化有關[7]。KANG 等[20]發現，SNI 大鼠上中等直徑DRG 神經元CaV3.2 T 型鈣通道的改變，可能是神經病理性疼痛的產生機制。JIANG 等[21]發現，在大鼠小直徑的DRG 神經元上，IgG 免疫復合物（IgG-IC）能激活Ⅰ型Fc-γ 受體介導疼痛的產生，大中直徑的DRG 神經元不存在該現象。本研究表明，大鼠DRG神經元的興奮性分型與其直徑大小存在關系。正常狀態下，大直徑的DRG 神經元主要是興奮性低的3 型細胞；而中、小直徑神經元主要是興奮性較高的1 型和2 型細胞。坐骨神經選擇性損傷后，大直徑的DRG神經元的3 型細胞構成比仍較中細胞高，但較小細胞之間的差異無統計學意義。

綜上所述，在神經病理性疼痛狀態下，DRG 神經元興奮性分型發生明顯改變，興奮性較高的1 型和2型細胞構成比增高，而興奮性較低的3 型細胞構成比降低，這可能是神經病理性疼痛狀態下產生痛覺過敏的機制之一。此外，大鼠DRG 神經元的直徑大小與其興奮性分型間存在關系，中小細胞的興奮性較大細胞興奮性高，表明中小細胞在神經病理性疼痛的產生過程中發揮更為重要的作用。但是在神經病理性疼痛狀態下，DRG 神經元興奮性分型改變的機制，以及不同直徑大小的DRG 神經元興奮性類型差異的機制仍有待探索。