核因子E2相關因子2在晶狀體上皮細胞抗氧化損傷中的作用*

朱麗華，李佳，李兵

（1.山東中醫藥大學附屬眼科醫院 山東省中西醫結合眼病防治重點實驗室，山東 濟南 250002；2.錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000）

全世界主要的致盲疾病中，白內障占首要位置。晶狀體上皮細胞是晶狀體前囊膜下一層單層細胞，維持晶狀體的正常代謝，阻擋房水內任何有害物質進入晶狀體，一旦晶狀體上皮細胞功能障礙，就會引起晶狀體代謝紊亂，出現混濁，最終導致白內障。白內障的誘發因素很多，氧化應激是主要原因，其次是細胞凋亡，氧化損傷也是細胞凋亡的誘發因素之一[1]。過量的活性氧（ROS）可以直接攻擊脂質、蛋白質和DNA，導致晶狀體受損，還可以作為信號通路的上游信號分子，激活細胞內多種信號轉導通路和轉錄因子并介導過氧化氫H2O2對晶狀體的損傷[2]。

核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是細胞抵御氧化損傷、抗凋亡的重要轉錄因子。近來研究發現，Nrf2 蛋白對各種以氧化應激和凋亡為主要發病機制的疾病都具有保護作用[3-4]。本研究主要探討Nrf2 在晶狀體上皮細胞對抗H2O2氧化損傷和凋亡的作用，并為今后探討防治白內障提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人晶狀體上皮細胞（SRA01/04）購自中國科學院上海細胞所，MEM 培養基購自美國BI 公司，活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，超氧化物酶歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Nrf2 一抗、剪切型Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Bax、Bcl-2 一抗購自美國Absci 公司，GAPDH、辣根過氧化物酶二抗購自杭州弗德生物公司，Dapi 染色液購自北京索萊寶公司，熒光二抗購自北京博奧森公司，核漿蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。

1.2 儀器和設備

恒溫水浴箱（上海森信RP-9160），轉印槽（美國Biorad 公司），垂直電泳槽（美國Biorad 公司），電泳凝膠成像分析系統（上海天能公司），臺式高速冷凍離心機（美國Beckman 公司），免疫熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標儀、流式細胞儀、超凈臺及孵育箱（美國Biorad 公司），恒溫搖床（美國Forma Scientific 公司），超微量分光光度計（美國Bioteck/EPoch 公司），制冰機（意大利Scotsman AF100 公司）

1.3 方法

1.3.1 細胞培養將SRA01/04 培養在含10%胎牛血清（FBS）的MEM 培養基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中培養，用0.25%胰酶常規傳代。

1.3.2 MTT 檢測不同濃度H2O2處理的SRA01/04 活性將細胞按照不同處理方式分組。分為正常對照組（不加入H2O2）、H2O250 μmol/L 組（加入50 μmol/L H2O2）、H2O2100 μmol/L 組（加入100 μmol/L H2O2）、H2O2200 μmol/L 組（加 入200 μmol/L H2O2）、H2O2300 μmol/L 組（加入300 μmol/L H2O2）和H2O2400 μmol/L 組（加入400 μmol/L H2O2）。取對數生長期的SRA01/04按2×103個/100μl 濃度接種在96 孔板，MEM 培養基（含10% FBS）培養24 h 使細胞貼壁，后加入稀釋好的含不同濃度H2O2的MEM 培養基中，分別培養24 和48 h 后酶標儀檢測光密度（OD）值。

1.3.3 細胞分組將細胞按照不同處理方式分組：正常對照組（不加入H2O2），H2O2低濃度組（H2O2濃度為100μmol/L），H2O2中濃度組（H2O2濃度為200μmol/L），H2O2高濃度組（H2O2濃度為300μmol/L），Nrf2 抑制組（GSK-3β+H2O2300μmol/L）。

1.3.4 流式細胞術檢測ROS 含量5 組細胞處理48h 后，將細胞收集于稀釋好的DCFH-DA 中，細胞培養箱中培養20min。用無血清培養液洗滌細胞3 次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.3.5 SOD 含量檢測將5 組細胞處理48h 后，收集細胞和上清液，每組分為空白管、對照空白管、測試管和對照測試管，混勻，37℃孵育20min，450nm處酶標儀讀數，細胞中SOD 活力=SOD 抑制率/ 50%×12×樣品稀釋倍數。

1.3.6 Western blotting 檢測Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白，Cleaved-Caspase-3，Bax 和Bcl-2 相對表達將5 組細胞處理48h 后，每組的1/2 細胞用于提取細胞中的核蛋白、漿蛋白，其余1/2 細胞用于提取總蛋白。考馬斯亮藍定量。蛋白經過SDS-PAGE 分離后轉移到PVDF 膜，用脫脂奶粉封閉1h，封閉好的PVDF 膜分別浸于不同的一抗孵育液里（兔抗Nrf2 以1 ∶500，兔抗Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 以1 ∶500 稀釋，兔抗GAPDH 以1 ∶1000 稀釋）4℃孵育過夜，TBST清洗。將PVDF 膜浸于辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1 ∶1000）孵育液中1.5h，TBST 清洗。利用高敏感性化學發光檢測方法成像。

1.3.7 免疫熒光檢測Nrf2 在細胞內的表達和定位將4 組細胞按3000 個/100μl 接種于有小圓玻片上的6 孔板上，在細胞培養箱貼壁24h，按照分組相應處理48h 后，磷酸鹽緩沖液沖洗玻片，4%多聚甲醛固定5min，磷酸鹽緩沖液沖洗玻片，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）透明10min 增加細胞膜通透性，1%牛血清白蛋白封閉1h，兔抗Nrf2 一抗4℃封閉過夜，羊抗兔二抗1h，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole 4',DAPI）染核10min，磷酸鹽緩沖液沖洗，將小圓玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以均數±標準（±s）表示，采用重復測量設計的方差分析和單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間的細胞活力比較

各個濃度實驗組與正常對照組不同時間點的細胞活力比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞活力有差異（F=268.540，P=0.000），處理時間為48h 時，細胞活力最低。②組間細胞活力有差異（F=126.450，P=0.001），在48h 時，各濃度組的細胞活力的變化最有意義。③各濃度實驗組與正常對照組的細胞活力變化趨勢有差異（F=254.110，P=0.002）。與正常對照組比較，H2O250μmol/L 組、H2O2100μmol/L 組、H2O2200μmol/L 組及H2O2300μmol/L組的細胞活力均下降（P＜0.05），當濃度為400μmol/L 時，細胞不可逆死亡。見表1。

2.2 各組ROS 含量比較

處理48h 后，各組ROS 含量的比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=2851.340，P=0.000），與正常對照組比較，各處理組的ROS 含量升高（P＜0.05），Nrf2 抑制組與H2O2高濃度組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1 和表2。

2.3 各組SOD 含量比較

處理48h 后，各組SOD 含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常對照組比較，各處理組的SOD 含量降低（P＜0.05），與H2O2高濃度組比較，Nrf2 抑制組SOD 含量減少（P＜0.05）。見表2。

表1 各組不同時間的細胞活力比較 （±s）

表1 各組不同時間的細胞活力比較 （±s）

組別 12 h 24 h 48 h正常對照組 0.762±0.113 0.756±0.021 0.751±0.020 H2O2 50 μmol/L 組 0.712±0.010 0.709±0.091 0.711±0.012 H2O2 100 μmol/L 組 0.586±0.041 0.487±0.030 0.411±0.012 H2O2 200 μmol/L 組 0.391±0.024 0.352±0.031 0.231±0.043 H2O2 300 μmol/L 組 0.305±0.102 0.272±0.087 0.178±0.010 H2O2 400 μmol/L 組 0.013±0.001 0.004±0.009 0.001±0.006

2.4 各組各蛋白表達的比較

處理48h 后，各組Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Nrf2 總蛋白、Nrf2 核蛋白、Nrf2 漿蛋白表達的比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，H2O2各個濃度組Bax 表達下降（P＜0.05）；與正常對照組比較，H2O2低濃度組Bcl-2 表達差異無統計學意義（P＞0.05），其余各組差異有統計學意義（P＜0.05）；H2O2各個濃度組Cleaved-Caspase-3 表達下降（P＜0.05）；各個濃度組Nrf2 總蛋白、核蛋白表達升高（P＜0.05）；Nrf2 漿蛋白表達下降（P＜0.05）。與H2O2高濃度組比較，Nrf2 抑制組Bax 表達升高（P＜0.05）、Bcl-2 表達降低（P＜0.05）、Cleaved-Caspase-3表達升高（P＜0.05），Nrf2 抑制組的Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白基本不表達。見圖2 和表3。

圖1 各組ROS 含量比較

表2 各組細胞ROS 和SOD 含量 （±s）

表2 各組細胞ROS 和SOD 含量 （±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與H2O2 高濃度組比較，P＜0.05

組別 ROS SOD正常對照組 46.52±3.25 89.93±2.29 H2O2 低濃度組 55.48±2.961） 72.00±7.731）H2O2 中濃度組 69.58±4.431） 52.70±6.081）H2O2 高濃度組 83.18±3.931） 45.08±5.471）Nrf2 抑制組 75.98±6.561） 13.78±4.841）2）F 值 22 851.349 12 075.170 P 值 0.000 0.000

圖2 Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3 及Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白的相對表達量

表3 各組細胞內各蛋白的相對表達比較 （±s）

表3 各組細胞內各蛋白的相對表達比較 （±s）

注：1）正常對照組比較，P＜0.05；2）與H2O2 高濃度組比較，P＜0.05

組別 Bax Bcl-2 Cleaved-Caspase-3 Nrf2 總蛋白 Nrf2 核蛋白 Nrf2 漿蛋白正常對照組 0.23±0.02 0.19±0.31 1.41±0.05 0.51±0.02 0.25±0.03 1.18±0.21 H2O2 低濃度組 0.13±0.111） 0.26±0.33 1.02±0.111） 0.59±0.031） 0.29±0.041） 0.87±0.181）H2O2 中濃度組 0.08±0.021） 0.42±0.051） 0.75±0.051） 0.81±0.071） 0.53±0.121） 0.40±0.071）H2O2 高濃度組 0.03±0.121） 0.61±0.041） 0.55±0.071） 1.10±0.101） 0.74±0.081） 0.16±0.031）Nrf2 抑制組 0.43±0.031）2 0.22±0.021）2） 0.92±0.121）2） 0.12±0.051）2） 0.10±0.031）2） 0.05±0.031）2）F 值 565.320 2 871.210 300.650 23.110 6 964.410 462.170 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 Nrf2 在細胞內的表達和定位

細胞經H2O2各濃度組處理48h 后，與正常對照組比較，Nrf2 表達增多，且發生核內轉移，H2O2高濃度組核內轉移最為明顯。Nrf2 抑制組檢測不到Nrf2的表達。見圖3。

3 討論

Nrf2 廣泛存在于多個組織器官內，在正常環境下的細胞中，Nrf2 處于靜止狀態，并不表達。當細胞處于氧化應激狀態時，Nrf2 與Keap1 解離并釋放[5-6]，Nrf2 進入細胞核，Nrf2-ARE 信號通路活化并發揮細胞保護作用，經研究證實，Nrf2-ARE 信號通路調節的內源性保護基因有200 多個，在增強組織抗氧化能力、保護組織細胞免受毒物損害、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤等方面起著非常重要的作用[7-8]。該信號通路上調其基因產物的表達對帕金森病、腦出血、白癜風、糖尿病腎病等均具有很強的組織細胞保護能力[9-11]。ROS能引起一系列的生化改變，包括脂質、蛋白、核酸損傷。晶狀體上皮細胞細胞膜由脂質組成。當受到自由基的攻擊，產生過氧化物。氧化損傷也可以讓蛋白結構和構向改變，導致晶狀體混濁，自由基也可以導致DNA損傷，引起細胞生物活性改變，導致細胞凋亡、突變，最終晶狀體變混濁。

圖3 Nrf-2 的表達和定位 （免疫熒光×200）

Bcl-2 家族與Caspase 家族，作為重要的抗凋亡蛋白，在線粒體通路中分別發揮著凋亡調節作用和凋亡執行作用。Bax、Bak 等存在于胞質中，是Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，而Bcl-2、Bcl-xL 等則是抑凋亡蛋白，位于線粒體膜上。Cleaved-Caspase-3 是Caspase家族中最重要的凋亡執行蛋白，是細胞凋亡的主要效應因子，它的活化表明細胞凋亡進入不可逆階段，是Caspase 家族中最重要的促凋亡蛋白。

筆者還發現，促凋亡基因Cleaved-Caspase-3 和Bax 隨H2O2濃度升高而下降，而抑凋亡蛋白Bcl-2 隨H2O2濃度升高而升高，表明晶狀體上皮細胞自身有抗一定的凋亡能力，推測這可能與晶狀體上皮細胞氧化應激后，Nrf2 表達增多有關。研究發現，Nrf2 的負性調節除了Keap1 之外，Gsk-3β 可以介導核內Nrf2 的出核降解，從而負性調節Nrf2 相關通路[12]。在本實驗中，當Nrf2 活性受到抑制后，晶狀體上皮細胞受到上游相同的ROS 的刺激，產生的抗氧化酶SOD 下降，促凋亡基因Cleaved-Caspase-3 及Bax 升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2 降低，驗證晶狀體上皮細胞自身的抗氧化應激與抗凋亡能力與Nrf2 表達有關。

隨著H2O2濃度的升高，Nrf2 蛋白表達增多，并且在H2O2中濃度組出現核易位趨勢，在H2O2高濃度組出現明顯核易位，這表明Nrf 表達增多和核易位增強了晶狀體上皮細胞自身抗氧化損傷的能力。

本研究顯示，Nrf2 蛋白表達和核易位在晶狀體上皮細胞自身抗氧化損傷和凋亡中起重要作用，可為白內障形成機制和藥物治療的研制提供一個新的思路。